معلومة

مجموعة بيانات للصور المجهرية قبل التلوين وبعده؟

مجموعة بيانات للصور المجهرية قبل التلوين وبعده؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا أبحث عن مجموعة بيانات من الصور المجهرية موزعة مجانًا. آمل أن أجد مجموعة بيانات تحتوي على صور نسيجية قبل التلوين وبعده (مثل H&E أو بعض المعايير القياسية الأخرى ، بشكل مفضل). لقد كنت أبحث في قواعد بيانات مختلفة ، لكن لا يمكنني العثور على المجموعة المناسبة. آمل أن يكون حجم العينة على الأقل حوالي 100. اقتراحات؟


دماغ الطيران الافتراضي (http://www.virtualflybrain.org/site/stacks/index.htm) هو قاعدة بيانات ممتازة للطيران (ذبابة الفاكهة) أقسام الدماغ ، والتي يمكن معالجتها إلكترونيًا / إضافة تعليقات توضيحية إليها / تسليط الضوء عليها أثناء الطيران لإظهار مناطق مختلفة من دماغ الذبابة كتراكب أعلى الصور الأصلية.

بدلاً من ذلك ، يمكنك استخدام BrainTrap (http://fruitfly.inf.ed.ac.uk/braintrap/) للتعبير عن البروتينات في الذبابة (ذبابة الفاكهة) الدماغ باستخدام أقسام الدماغ. قاعدة بيانات أخرى بها بقع فضية من ذبابة الفاكهة أقسام الدماغ هي قاعدة بيانات flybrain (http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/). تحتوي قاعدة البيانات هذه أيضًا على نماذج ثلاثية الأبعاد لهياكل دماغية مختلفة وأكثر من ذلك بكثير!

أنا متأكد من وجود العديد من قواعد البيانات المتشابهة ، ولكن هذه هي تلك التي أعرفها ، والتي تستخدم على نطاق واسع في ذبابة الفاكهة تواصل اجتماعي.


تلطيخ العينات المجهرية

في حالتها الطبيعية ، تفتقر معظم الخلايا والكائنات الحية الدقيقة التي نلاحظها تحت المجهر إلى اللون والتباين. هذا يجعل من الصعب ، إن لم يكن من المستحيل ، اكتشاف الهياكل الخلوية المهمة وخصائصها المميزة دون معالجة العينات بشكل مصطنع. لقد أشرنا بالفعل إلى تقنيات معينة تتضمن البقع والأصباغ الفلورية ، وفي هذا القسم سنناقش تقنيات محددة لتحضير العينات بمزيد من التفصيل. في الواقع ، تم تطوير العديد من الطرق لتحديد الميكروبات المحددة ، أو الهياكل الخلوية ، أو تسلسل الحمض النووي ، أو مؤشرات الإصابة في عينات الأنسجة ، تحت المجهر. هنا ، سنركز على التقنيات الأكثر صلة سريريًا.


تعريف اللاكتوفينول القطني الأزرق

لاكتوفينول بلو محلول أو لاكتوفينول قطن أزرق هو وسط رطب وعامل تلطيخ يستخدم لتحضير الشرائح المجهرية للفطريات للفحص. العناصر الفطرية ملطخة بشكل مكثف باللون الأزرق.

قد تفكر ، لماذا يجب أن نتعلم هذه التقنية أو ما هو الغرض من هذه التقنية.

حسنا، انها بسيطة جدا.

الفطريات هي نوع من الكائنات حقيقية النواة ، وتنقسم إلى مجموعتين رئيسيتين هما الخميرة والعفن ، وتحتوي على مادة الكيتين على جدارها الخلوي. لديهم بنية مجهرية ولهذا لا يمكننا رؤيتهم بالعين المجردة. يمكننا رؤيتها تحت المجهر عن طريق تلطيخها بالبقع المناسبة.

هذه الخلايا الفطرية مفيدة وكذلك ضارة للإنسان لأنها تنتج العديد من المضادات الحيوية والمنتجات الطبيعية وكذلك تستخدم في عملية التخمير الصناعية. تعد الخلايا الفطرية ضارة بمعنى أنها تسبب أمراضًا للإنسان وتنتج مواد سامة وتضر بالمحاصيل المهمة.

من المهم جدًا فحص الأنواع الفطرية ، حتى نتمكن من التحكم فيها أو يمكننا إنتاج أدوية للعدوى الفطرية. قبل فحص الخلايا الفطرية تحت المجهر نحتاج إلى صبغها وهي خطوة مهمة.

يمكن أن يتم تلطيخ الخلايا الفطرية بواسطة Lactophenol Cotton Blue. هذه بعض الأمثلة على الفطريات Rhizopus و Aspergillus و Penicillium و Fusarium و Candida و Mucor وما إلى ذلك. هنا سنقوم بتلوين الخلايا الفطرية بمساعدة طريقة اللاكتوفينول القطنية الزرقاء ، وتسمى تقنية التلوين هذه أيضًا بتركيب الفطريات.

على الرغم من وجود العديد من المعايير عند تحديد القوالب مثل الخصائص الثقافية ، وتحمل درجة الحرارة ، والملامح الغذائية ، والاختبارات البيوكيميائية المختلفة ، تؤكد مخططات التصنيف الحديثة على السمات المورفولوجية المجهرية المستقرة وتظهر الحد الأدنى من التباين. يعتمد التحديد النهائي للقوالب على شكل الجراثيم وطريقة إنتاجها وترتيباتها (تكوين الجنين الصخري).


حلول مجهرية لعلم الأنسجة وعلم التشريح المرضي

يهدف علم الأمراض أو علم الأنسجة أو علم الأنسجة إلى دراسة مظاهر المرض عن طريق الفحص المجهري لتشكل الأنسجة. في علم الأمراض ، عادة ما تكون العينة التي يتم فحصها تحت المجهر نتيجة لعملية جراحية أو خزعة أو تشريح بعد التثبيت والمسح / التضمين وتقطيع عينة الأنسجة. بدلاً من ذلك ، تتم معالجة القسم المجمد باستخدام ناظم البرد عند الحاجة إلى نتائج سريعة (على سبيل المثال أثناء الجراحة) أو يكون التثبيت ضارًا بالبنى المستهدفة مثل الدهون أو بعض المستضدات. عادةً ما يتم تقطيع أقسام الأنسجة بعد التثبيت ودمج الشمع إلى شرائح رفيعة من 2 إلى 5 ميكرون مع مبضع قبل التلوين ونقلها إلى شريحة زجاجية لفحصها باستخدام مجهر ضوئي. العينات النموذجية في علم الأمراض هي القولون أو الكلى أو البنكرياس أو عنق الرحم أو الرئة أو الثدي أو البروستاتا أو النسيج الضام.

في حين تم تطوير إجراءات تلطيخ مختلفة للأنسجة البشرية / الحيوانية والنباتية في وقت مبكر من القرن السابع عشر ، كان الطبيب الألماني رودولف فيرشو هو أب علم التشريح الحديث. أدرك فيرشو إمكانات تقنيات المجهر الجديدة الناشئة في القرن التاسع عشر لأبحاثه الرائدة ، ونشر قدرًا هائلاً من الكتابات العلمية وأنشأ مجموعة رائعة من آلاف شرائح عينات الأنسجة المرضية ، مما أدى إلى بناء أساس علم الأنسجة الحديث وأبحاث السرطان.

يبدأ تحضير شريحة الأنسجة بتثبيت عينة الأنسجة. هذه خطوة حاسمة في تحضير الأنسجة ، والغرض منها هو منع التحلل الذاتي للأنسجة والتعفن. للحصول على أفضل النتائج ، يجب نقل عينات الأنسجة البيولوجية إلى مادة مثبتة فور جمعها ، وعادة ما تكون في شكل فورمالين محايد بنسبة 10٪ لمدة 24 إلى 48 ساعة. بعد التثبيت ، يتم قطع العينات باستخدام مشرط لتمكينها من وضعها في كاسيت مناديل مناسب يتم تخزينه في الفورمالين حتى تبدأ المعالجة.

الخطوة الأولى في المعالجة هي الجفاف ، والذي يتضمن غمر العينة في تركيزات متزايدة من الكحول لإزالة الماء والفورمالين من الأنسجة. المقاصة هي الخطوة التالية ، حيث يتم استخدام مذيب عضوي مثل الزيلين لإزالة الكحول والسماح بالتسلل بشمع البرافين. التضمين هو الخطوة الأخيرة ، حيث يتم اختراق العينات بعامل التضمين - عادةً شمع البارافين الذي يوفر مصفوفة دعم تسمح بتقطيع رفيع جدًا. يتم استخدام مبضع لتقطيع أقسام الأنسجة الرفيعة للغاية من الكتلة على شكل شريط ، بعد تلطيخ النسيج الكيميائي (عادةً الهيماتوكسيلين ويوزين - "صبغة HE") لتوفير تباين لأقسام الأنسجة ، مما يجعل هياكل الأنسجة مرئية بشكل أفضل ويسهل تقييمها . في بعض الحالات ، تكون اللطخات الكيميائية النسيجية المناعية (IHC) ، مثل HER2 أو Ki-67 ، مطلوبة لمزيد من التحليل.


3. إعداد الشبكة

بمجرد أن تصبح العينة جاهزة ، يجب تحضيرها للتصوير بواسطة EM. للتصوير بالإلكترونات ، يتم الاحتفاظ بالمجهر تحت فراغ عالي ، حيث تجف العينات البيولوجية المائية بسرعة. وبالتالي لتصوير عينة بيولوجية ، يجب أن تكون ثابتة ، ويفضل أن تكون في حالة أصلية (أو شبيهة بالأصل). اعتبار آخر هو سماكة العينة. في بعض الحالات ، قد تكون العينة سميكة جدًا بحيث لا يمكن نقل الإلكترونات & # x02018 & # x02019 ، وهو شرط أساسي للإرسال EM ، وبالتالي قد تحتاج العينة إلى المعالجة لجعلها أرق. يتم تحديد اختيار تقنية التحضير في نهاية المطاف من خلال طبيعة العينة والقرار المطلوب للرؤية البيولوجية المقصودة ، ولكن الطرق الشائعة تشمل التلوين السلبي ، والتضمين / التقسيم البلاستيكي ، والتزجيج.

يبلغ عرض شبكات EM بشكل تقليدي 3.05 & # x000a0mm ، وهي مصنوعة من شبكة من المعدن مثل النحاس والذهب والنيكل والموليبدينوم أو الروديوم. يتم استخدام شبكات النحاس بشكل أكثر شيوعًا ، لكن دعامات الذهب أصبحت أكثر شيوعًا ، خاصةً عندما يتم زراعة الخلايا مباشرة على الشبكة ، لأنها غير سامة للخلايا. تدعم الشبكة المعدنية الفيلم في الأعلى. يتم تعريف حجم الشبكة ، أو عدد المربعات عبر الشبكة ، على أنه عدد المربعات في البوصة الواحدة. على سبيل المثال ، تحتوي الشبكة المكونة من 200 شبكة على 20 مربعًا في كل اتجاه ، و 300 شبكة 30 مربعًا. يتم استخدام شبكات 200 & # x02013400 بشكل شائع في cryo-EM. فوق الدعامة المعدنية ، يتم ترسيب فيلم دعم ، وتستخدم أغشية دعم مختلفة لأغراض مختلفة (القسم 3.3). توفر أحجام الشبكات الدقيقة مزيدًا من الدعم للفيلم ، ولكن عند إمالة الشبكة ، يمكن للقضبان أن تسد الحزمة. لذلك ، يتم استخدام 200 شبكة شبكية بشكل شائع لجمع بيانات سلسلة الإمالة.

3.1. تلطيخ سلبي

الاستخدام النموذجي: إن التباين العالي وسرعة تحضير الشبكة للعينات الملطخة السلبية تجعلها مثالية لتقييم نقاء العينة والتركيز وعدم التجانس والمرونة المطابقة. يمكن أن توفر عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد منخفضة الدقة من البيانات الملطخة أيضًا نماذج بدء لدراسات cryo-EM عالية الدقة.

المزايا: سرعة عالية في تحضير العينات وتباين جيد للعينة. بالإضافة إلى ذلك ، هناك القدرة على التوسيم بالأجسام المضادة أو الذهب للمساعدة في مزيد من الدراسات الوظيفية وتحديد قياس العناصر المتفاعلة. يمكن الاحتفاظ بالشبكة بسهولة لسنوات عديدة وإعادة تصويرها.

العيوب: الهياكل محدودة الدقة المتواضعة (& # x0223c & # x0003e20 & # x000a0 & # x000c5) ، طوبولوجيا السطح فقط ، إمكانية تلطيخ القطع الأثرية ، غير متوافقة مع بعض المخازن المؤقتة و / أو الكواشف.

تعتبر البقعة السلبية طريقة شائعة لفحص عينة ، خاصة المجمعات الجزيئية ، في درجة حرارة الغرفة. تم توثيق العديد من الاختلافات في تقنية التلوين السلبي منذ أواخر الخمسينيات ، باستخدام العديد من بقع المعادن الثقيلة المختلفة [18]. عادةً ما يتم امتصاص العينات على فيلم دعم كربوني رفيع (& # x0223c10 & # x000a0nm) تم تحويله إلى ماء (القسم 3.3). يتم تلطيخها بعد ذلك بمحلول ملح معدني ثقيل ، عادةً 1 & # x020132٪ (w / v) أسيتات اليورانيل أو فورمات اليورانيل وتنشيفها لضمان طبقة رقيقة من البقع ، مع عدم انتقال البقعة إلى الجانب الخلفي للشبكة. من المعروف أن بعض مكونات المخزن المؤقت الشائعة (الجدول 1) تؤثر سلبًا على جودة التلوين. ومع ذلك ، فإن التخفيف الكبير لعينة مركزة مع مخزن مؤقت متوافق مباشرة قبل التطبيق على الشبكة هو أسهل طريقة لتحسين ذلك. إذا لم يكن ذلك ممكنًا ، فإن غسل الشبكة قبل التلوين يعد أيضًا خيارًا. عملية التلوين تجفف العينة بسرعة وتغلفها في البقعة (حيث يتم تصور العينة بغياب البقعة ، يحدث تلطيخ سلبي حيث تصبح العينة نفسها ملطخة ، ويحدث تلطيخ إيجابي) (الشكل 2). تولد الغلاف الناتج لذرات المعادن الثقيلة تباينًا في السعة ، ونسبة إشارة إلى ضوضاء عالية نسبيًا (تمت مراجعة تكوين الصورة في TEM في [12]). يجب تحقيق عمق البقعة الصحيح للحصول على التصوير الأمثل ، مع فقدان المعلومات عندما تكون البقعة عميقة جدًا أو ضحلة جدًا. يعتبر جفاف العينة وتشوهها أثناء الامتزاز من عيوب تحضير عينة البقعة السلبية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن دقة الصور الملطخة محدودة بحجم حبيبات البقعة ، والتي تحدد مدى جودة انعكاس مظروف البقعة على بنية الكائن [19]. يمكن أن يؤدي استخدام فيلم دعم الكربون المستمر إلى اعتماد عينات لاتجاه مفضل على الشبكة ، مما يعقد تحديد الهيكل ثلاثي الأبعاد بسبب نقص المشاهدات. على الرغم من هذه المشاكل ، يمكن للعينات الملطخة السلبية أن تولد بيانات ثلاثية الأبعاد وتوفر رؤية بيولوجية لا تقدر بثمن [20] ، [21]. على سبيل المثال ، يمكن استخدام التلوين السلبي لتوضيح ارتباط مثبطات الجزيئات الصغيرة في غضون أسابيع [22] ، وتقييم التغييرات التوافقية [23] ، [24] ، والاستقرار المعقد [25] والقياس المتكافئ للوحدة الفرعية / الموضع [26] ، [27]. تمت مراجعة عملية التلوين السلبي بالكامل في [28].

التلوين الإيجابي والسلبي باستخدام أملاح المعادن الثقيلة. في التلوين السلبي (أ) ، تغلف البقعة المركب الجزيئي بالكامل في الصورة المجهرية ، يظهر المجمع أبيض اللون على خلفية داكنة. ينتج عن التلوين الإيجابي (B) كمية صغيرة من البقع تشكل قشرة رقيقة حول الجزيء ، مما يعني أن العينة تبدو داكنة على خلفية فاتحة.

يمكن أيضًا دمج التلوين السلبي مع التزجيج (القسم 3.2) ، في تقنية تحضير العينة المعروفة باسم التلوين السلبي بالتبريد. تجمع هذه الطريقة بين التباين العالي لاستخدام صبغة المعادن الثقيلة والتأثيرات الوقائية للحفظ المبرد (تمت المراجعة في [29]).

3.2 التزجيج

تتضمن تقنيات تحضير العينات مثل التلوين والدمج البلاستيكي تجفيف العينات البيولوجية ، مما يزيلها بشكل أساسي من بيئتها المائية الأصلية. يحافظ تجميد الحركة بالتبريد على البيئة المائية ، بينما يخفف أيضًا الضرر الإشعاعي [30]. يُعرف تصوير العينات المجمدة بواسطة EM باسم cryo-EM. يجب تجميد العينة بسرعة كبيرة بمعدل & # x0223c10 6 & # x000a0 & # x000b0C / s ، بحيث يتم إصلاح الماء الموجود في العينة ومحيطها في الحالة الزجاجية [31]. إذا حدث التجميد ببطء شديد ، أو تم تسخين العينة فيما بعد فوق & # x02212137 & # x000a0 & # x000b0C ، درجة الحرارة التي ينفجر عندها الماء [31] ، يتشكل الجليد البلوري. في تجربتنا ، فإن تسخين العينة أكثر من & # x0223c & # x02212160 & # x000a0 & # x000b0C يمكن أن يؤدي إلى انخفاض جودة الثلج. يؤثر تلوث الجليد على السلامة الهيكلية للعينة ، حيث تسحب البلورات جزيئات الماء من قشور الماء للعينة ، أو العينة نفسها (الشكل 3). يؤدي تكوين الجليد البلوري أيضًا إلى تدهور جودة الصورة أثناء انحراف الإلكترونات. يمكن أن يحدث التلوث أيضًا أثناء عملية التجميد ، مثل الجليد السداسي ، والذي يمكن تقليله من خلال العمل في بيئات يتم التحكم فيها بالرطوبة وتقليل تلوث الجليد في النيتروجين السائل.

أمثلة على الجليد الزجاجي وغير الزجاجي. أ) الجليد الزجاجي الفارغ (شريط المقياس 50 & # x000a0nm). ب) الجليد السداسي (شريط المقياس 400 & # x000a0nm). ج) بلورة ثلجية كبيرة (سهم أبيض) (شريط مقياس 400 & # x000a0nm). د) التلوث المحتمل بالإيثان (شريط المقياس 200 & # x000a0nm).

على الرغم من أن cryo-EM قيد التطوير منذ السبعينيات ، إلا أن العدد الكبير من الهياكل عالية الدقة المودعة في العامين الماضيين قد عزز الاهتمام المتزايد بهذه التقنية [32] ، [33] ، [34] ، [35] ، [ 36]. هنا ، تتم مناقشة طرق تجميد الحركة.

3.2.1. تجميد الغطس

الاستخدام النموذجي: مجموعة واسعة من العينات ، من الجزيئات الصغيرة (& # x0223c150 & # x000a0kDa) إلى الخلايا حقيقية النواة الكاملة يمكن تزجيجها وتصويرها بواسطة cryo-EM.

المزايا: يتم تصور العينة في حالة تشبه الأم. يمكن أن ينتج عن معالجة البيانات معلومات هيكلية ثلاثية الأبعاد عالية الدقة.

العيوب: يجب تصوير العينات البيولوجية بجرعات منخفضة من الإلكترون لمنع الضرر الإشعاعي الذي ينتج عنه تباين ضعيف. في بعض الأحيان يكون من غير المهم تحسين توزيع العينات وسماكة الجليد.

بالنسبة للعينات الرقيقة مثل معلقات الجزيئات الكبيرة ، أو البلورات ثنائية الأبعاد أو ثلاثية الأبعاد الصغيرة جدًا ، والخلايا الصغيرة ، والحافة الرقيقة للخلايا الأكبر حجمًا ، يمكن تحقيق التثبيت بالتبريد عن طريق النشاف لتوليد طبقة رقيقة من السائل تحتوي على العينة ، ثم التجميد السريع عن طريق الانغماس في كريوجين (الشكل 4). أكثر المواد المبردة استخدامًا هي الإيثان السائل أو البروبان ، المبردة بالنيتروجين السائل [37]. تستخدم العينات الرقيقة للتجميد الغاطس لمجموعة واسعة من العينات. لكل منها ، يجب أن تكون طبقة الجليد رفيعة قدر الإمكان دون تشويه العينة وأثناء دمج الجسيم بالكامل ، لزيادة تباين العينة إلى أقصى حد. يمكن أن يؤدي عدم تضمين العينة بالكامل إلى تلف إشعاعي تفضيلي للعينة خارج طبقة الجليد. يمكن إجراء عملية النشاف والغمر باستخدام أجهزة بسيطة ، غالبًا ما تكون مُصنَّعة في المنزل [38]. ومع ذلك ، غالبًا ما تكافح هذه الأجهزة لتوفير نتائج متسقة داخل وبين مجموعات الشبكات المعدة. تتوفر العديد من الأدوات التجارية التي تحقق المزيد من النتائج القابلة للتكرار ، بما في ذلك النماذج من قبل FEI و Leica و Gatan (الجدول 2). يوفر جهاز التجميد المتاح تجاريًا ميزات مختلفة قد تكون مفيدة عند العمل مع عينات معينة. على سبيل المثال ، قد يكون النشاف أحادي الجانب مفيدًا عند تحضير شبكات من الخلايا الملتصقة. يمكن أن يؤدي النشاف على الوجهين إلى تجريد بعض الخلايا من الشبكة وعلى الورق النشاف. يمكن إجراء النشاف على جانب واحد من & # x02018back side & # x02019 من النطاق ، حيث لا يتم الالتزام بالخلايا ، مما يؤدي إلى التحايل على المشكلات التي يسببها النشاف على الوجهين. بالإضافة إلى ذلك ، قد تستفيد بعض المجمعات الجزيئية من درجة حرارة منخفضة (& # x0003c5 & # x000a0 & # x000b0C) و / أو التحكم في الرطوبة في غرفة التجميد. قد تؤثر هذه الاعتبارات على اختيار جهاز التجميد ، حيث يكون الاختيار متاحًا.

التصوير متعدد المقاييس عن طريق cryo-EM. أ) الخلايا حقيقية النواة (شريط المقياس 6 & # x000a0 & # x003bcm). ب) الخلايا بدائية النواة (شريط المقياس 0.5 & # x000a0 & # x003bcm). ج) العضيات المعزولة ، في هذه الحالة الميكروسومات (شريط المقياس 200 & # x000a0nm). د) الجسيمات الشحمية الاصطناعية (شريط المقياس 100 & # x000a0nm) هـ) الفيروسات (شريط المقياس 50 & # x000a0nm). و) المجمعات الجزيئية (شريط المقياس 25 & # x000a0nm).

الجدول 2

مقارنة بين أجهزة التجميد الغاطس المتوفرة تجاريًا.

نموذجالتحكم في الرطوبة في الغرفةالتحكم في درجة الحرارة في الغرفةالتحكم الآلي في درجة حرارة الإيثانطريقة النشافمعلومة اضافية
لايكا إم جي بي& # x02713& # x02713& # x02713جانب واحدمجسم مجسم اختياري لمراقبة النشاف
Gatan Cryo-يغرق 3& # x02715
(الغرفة 98٪)
& # x02715
(تعمل في درجة حرارة الغرفة)
& # x02713جانب واحد ومزدوجةغرفة رطوبة قابلة للإزالة
FEI Vitrobot& # x02713& # x02713& # x02715بجانبينحاليًا أكثر أجهزة التجميد الغاطسة شيوعًا.

في العديد من المنشآت ، يتم تحضير مجموعات واسعة من العينات باستخدام نفس أداة التجميد الغاطس. يجب توخي الحذر لإزالة تلوث الجهاز بشكل مناسب بعد الاستخدام ، على سبيل المثال باستخدام 70٪ (حجم / حجم) إيثانول. بالنسبة للعينات التي تمثل خطرًا حيويًا ، يمكن وضع المجمدات الغاطسة في خزانة السلامة الأحيائية. هذا يحمي المستخدم من الهباء الجوي ، ويمكن من تبخير الجهاز ، مما يعزز السلامة الحيوية.

3.2.2. تجميد عالي الضغط

الاستخدام النموذجي: العينات السميكة مثل المنطقة النووية للخلايا حقيقية النواة وأقسام الأنسجة والكائنات الحية الكاملة مثل Caenorhabditis elegans التي لا يمكن تحضيرها بالتجميد الغاطس.

المزايا: يتم الاحتفاظ بالعينة في حالة تشبه الأم. يمكن أن ينتج عنه معلومات هيكلية ثلاثية الأبعاد عالية الدقة.

العيوب: لكي يتم تصورها بواسطة TEM ، أي أن تصبح شفافة الإلكترون ، يجب أن يتم تقسيم العينة أو تخفيفها بواسطة طحن شعاع أيوني مركّز (FIB) بعد التجميد. هناك إمكانية لتوليد المشغولات اليدوية في هذه العملية ، ويمكن أن تكون صعبة من الناحية الفنية.

بينما قد يتم تزجيج عينات أرق من حافة الخلايا الكبيرة عن طريق التجميد الغاطس ، فإن العينات الأكثر سمكًا (& # x0003c1 & # x000a0 & # x003bcm) مثل المناطق النووية وما حول النواة للخلايا حقيقية النواة أو أقسام الأنسجة من المرجح أن تواجه بعض تكوين الجليد البلوري أثناء الغطس التجميد. بالنسبة لهذه العينات ، يعد التجميد عالي الضغط (HPF) بديلاً فعالاً. يتضمن HPF رفع ضغط العينة إلى & # x0223c2000 & # x000a0bar أثناء خفض درجة الحرارة باستخدام النيتروجين السائل [39]. بالنسبة للعينات & # x0003e100 & # x000a0 & # x003bcm بسمك يصل إلى & # x0223c300 & # x000a0 & # x003bcm ، يمكن تزجيجها باستخدام HPF ، ولكن يجب تقسيمها لاحقًا لتكون رقيقة بما يكفي لـ TEM. يمكن إجراء التقسيم في ظل ظروف شديدة البرودة ، مما يوفر أفضل حماية للعينة. هذه التقنية ، المعروفة باسم الفحص المجهري الإلكتروني للأقسام الزجاجية (CEMOVIS) ، تستخدم تقنية التجميد الدقيق للغاية بسكين ماسي لإنتاج المقاطع 40 & # x02013100 & # x000a0nm سميكة [40] ، [41] ، [42]. إنها تقنية مفيدة ، قادرة على تصوير عينات سميكة في حالة تشبه الأصلية ، لكنها صعبة للغاية من الناحية الفنية. نهج بديل شائع لإجراء استبدال التجميد على العينة ، مما يتيح التقسيم والتصوير في درجة حرارة الغرفة [43] ، [44]. يتضمن الاستبدال بالتجميد تسخين العينة تدريجياً واستبدال الماء بالأسيتون. يمكن بعد ذلك تلطيخ العينة ، وتضمينها في الراتنج ومقطعة. يقدم استبدال التجميد عددًا أقل من المصنوعات اليدوية مقارنة بالتضمين البلاستيكي التقليدي ، ولكن تتشكل بلورات الجليد الصغيرة مما يتسبب في إعادة ترتيب هياكل الخلايا ، والتلطيخ ليس موحدًا ، لذا قد يكون تفسير الصور أمرًا صعبًا.

بديل للتقطيع هو استخدام طحن FIB لتقليل سماكة العينة [45] ، [46]. يتم إجراء طحن FIB على عينات رطبة مجمدة في جهاز EM / FIB مسح مزدوج الشعاع [47]. يتم تنقيط حزمة مركزة من الأيونات عبر سطح العينة ، وإزالة الذرات السطحية في عملية تعرف باسم الرش. يسمح المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) بالمراقبة المتزامنة وغير المدمرة لعملية الطحن [47]. يشيع استخدام أيونات الغاليوم بسبب تقلبها وانخفاض درجة انصهارها [47]. يتم إنشاء شعاع الأيونات بواسطة مصدر أيون معدني سائل ويتم تحريره بواسطة قطب استخلاص. تُستخدم العدسات والفتحات الكهرومغناطيسية لتركيز الحزمة الأيونية ، والعواكس للتحكم في نمط الطحن. يمكن لطحن FIB أن يدخل المصنوعات اليدوية ، حيث يمكن إعادة ترسب المواد المتناثرة على سطح العينة ، على الرغم من أن جهاز مكافحة التلوث المبرد والموضع بشكل مناسب يمكن أن يقلل من ذلك. يمكن أن تنتج معدلات الطحن التفاضلية أيضًا خطوطًا أو تقطيعًا عبر السطح ، ويمكن أيضًا حدوث تسخين محلي / إزالة مزج. ومع ذلك ، فقد تم تحديد الظروف التي لا ترتفع فيها درجات الحرارة بشكل كافٍ لتكون هذه مشكلة روتينية [48]. يمكن اتخاذ خطوات محددة لضمان سطح أملس أثناء الطحن ، مثل استخدام نظام حقن الغاز لإنشاء طبقة بلاتين معدني عضوي تغطي العينة ، والتي تحميها من بعض المصنوعات اليدوية التي تسببها الرش غير المنتظم أثناء الطحن [49]. يمكن استخدام طحن FIB بالتزامن مع التصوير بواسطة SEM ، كما هو الحال في التصوير المتسلسل للوجه الكتلي ، أو نقل العينة المطحونة إلى TEM [45] ، [46]. منذ أول تجربة ناجحة لـ Cryo-FIB في عام 2003 [50] ، تم تطوير تدفقات العمل لتحسين التقنية وتحسينها بما في ذلك فى الموقع تحضير الصفيحة البردية للخلايا المزروعة على شبكات EM. لا تزال تقنية Cryo-FIB تطورًا واحدًا مثيرًا بشكل خاص وهو تنفيذ الفحص المجهري للضوء المترابط بالاشتراك مع طحن FIB [51].

3.3 أفلام دعم

أحد الاعتبارات الرئيسية في إعداد الشبكة هو اختيار الشبكة وفيلم الدعم. بالنسبة للأفلام الكربونية المثقبة المبردة بالتبريد الكهرومغناطيسي ، تُستخدم عمومًا ، مما يسمح بتصوير العينة في الجليد المعلق بين الثقوب في فيلم دعم الكربون. تستخدم أفلام الكربون المستمرة للتلوين السلبي. ومع ذلك ، في تجربتنا يمكن أن يكون للعينات ارتباطات مختلفة بشكل كبير لأغشية الكربون. يمكن تغيير خصائص سطح الكربون من خلال مجموعة متنوعة من العمليات ، بما في ذلك التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، وتفريغ الوهج ، والبولي- l -lysine أو معالجة المنظفات [52] ، [53]. في cryo-EM ، يمكن أن يؤدي تغيير خصائص الشحن لغشاء الكربون إلى تغيير تقسيم العينة في الثقوب ، ولكن هذا يحتاج إلى تحسين لكل عينة. تحتوي بعض العينات على درجة عالية جدًا من التقارب لفيلم الكربون ، وتستفيد هذه العينات أحيانًا من طبقة كربون رقيقة ومستمرة يتم وضعها فوق الفيلم المثقوب. يمكن لطبقة الكربون هذه تحسين توزيع الجسيمات ، ولكن يجب أن تكون رقيقة (& # x0003c10 & # x000a0nm) لمنع إضافة ضوضاء مفرطة للصور. يمكن أيضًا أن تكون هذه الأغشية الكربونية الرقيقة هشة للغاية ، لذلك هناك مقايضة بين ثبات الكربون والسمك. تتوفر أفلام الكربون غير المتبلورة المثقبة تجارياً ، ويمكن أن تتكون من صفائف منتظمة ذات ثقوب متساوية الحجم ، كما هو الحال مع شبكات Quantifoil & # x000ae و C-Flat & # x02122 ، أو غير منتظمة ، كما هو الحال في الكربون اللاسي. يمكن أيضًا شراء شبكات أفلام الكربون المثقبة ذات طبقة رقيقة جدًا (3 & # x020135 & # x000a0nm) من الكربون بشكل تجاري ، أو صنعها في المنزل.

تستخدم أفلام دعم الكربون غير المتبلورة على نطاق واسع ، ولكنها لا تخلو من مشاكلها. يمكن أن تكون غير متسقة بين الدُفعات ، ويمكن أن تتدهور جودة فيلم الكربون غير المتبلور بمرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، يساهم عدم استقرار أغشية الكربون غير المتبلورة في حركة الجسيمات التي يسببها الشعاع ، مما يؤدي إلى تشويش صورة العينة [54]. يتم تطوير مواد جديدة لمعالجة هذه المشكلات ، بما في ذلك أغشية دعم الذهب والجرافين وأغشية كربيد السيليكون المخدر ، والتي يبدو أنها تقلل من حركة الجسيمات التي يسببها الشعاع [55] ، [56] ، [57]. التحسينات التي يتم إجراؤها على الأفلام الداعمة لديها القدرة على زيادة جودة كل من جمع بيانات cryo-EM المائل وغير المائل.


هيكل الأميبا

كما ذكرنا سابقًا ، الأميبات هي حقيقيات النوى ، مما يعني ببساطة أن لديها غشاء خلويًا يحيط بالسيتوبلازم والحمض النووي الخاص بها معبأ بشكل صحيح في النواة المركزية.

عند النظر إليها تحت المجهر ، فإن هذه الجوانب من الكائن الحي تكون مرئية بوضوح خاصة عندما تكون العينة ملطخة.

بعض العضيات الأخرى التي يمكن رؤيتها تحت المجهر تشمل:

* فيما يتعلق ببنيتها ، الأميبات تشبه إلى حد كبير خلايا الحيوانات العليا مثل تلك الموجودة في البشر.


القياسات وتحليل البيانات

يقيس CellProfiler عددًا كبيرًا من الميزات لكل خلية أو حجرة فرعية محددة ، بما في ذلك المنطقة والشكل والكثافة والملمس (كل ميزة موصوفة في ملف بيانات إضافي 4). يتضمن هذا العديد من الميزات القياسية [39 ، 40] ، ولكن أيضًا القياسات المعقدة مثل ميزات شكل Zernike [41] ، وميزات نسيج Haralick و Gabor [42-44] ، والتي تم وصفها بالتفصيل في التعليمات والدليل عبر الإنترنت. هناك أيضًا وحدات لقياس الميزات المختلفة (على سبيل المثال ، الكثافة ، والملمس ، والتشبع ، والتمويه ، والمساحة التي تشغلها البقعة) للصورة بأكملها. يتمثل أحد القيود الشديدة لمعظم البرامج التجارية في عدم القدرة على التكيف مع الأسئلة البيولوجية الجديدة عن طريق حساب الميزات الجديدة من الخلايا المحددة [5]. على النقيض من ذلك ، يسمح التصميم المعياري لـ CellProfiler والشفرة مفتوحة المصدر بقياس الأنماط الظاهرية الخلوية الجديدة بسرعة حسب الحاجة.

يمكن الوصول إلى القياسات بعدة طرق: استخدام أدوات عرض البيانات المضمنة في CellProfiler (ملف بيانات إضافي 5) والتصدير بتنسيق جدول بيانات محدد بعلامات جدولة يمكن فتحه في برامج مثل Microsoft Excel أو تصدير OpenOffice Calc بتنسيق يمكن أن يكون استيرادها إلى قاعدة بيانات مثل Oracle أو MySQL أو مباشرة في MATLAB.


إجراء

لخلية قشر البصل

  • قشر جزء صغير من قشر البصل
  • ضع قشر البصل في وسط الشريحة
  • ضع قطرتين من الماء على قشر البصل. يسمى هذا "التثبيت الرطب"
  • بدءًا من حافة واحدة ، قم بخفض الغطاء برفق فوق قشر البصل
  • اضغط برفق على الشريحة بقلم رصاص لإزالة أي فقاعات هواء
  • ضع قطرة من اليود على حافة واحدة من ساترة. المس الحافة المقابلة للساترة بمنشفة ورقية لرسم البقعة تحت الانزلاق
  • ضع الشريحة على المسرح تحت طاقة منخفضة. استخدم مقبض الضبط الخشن للتركيز
  • قم بتدوير قطعة الأنف إلى قوة متوسطة. استخدم مقبض الضبط الدقيق للتركيز. راقب ما تراه
  • كرر الخطوة 8 ، ولكن هذه المرة انتقل إلى الطاقة العالية وارسم ما تراه (استخدم قلم رصاص)
  • بعد رسم المخططات الخاصة بك ، قم بتدوير قطعة الأنف مرة أخرى إلى طاقة منخفضة. أزل الشريحة وتخلص من قطعة البصل ، واغسل الشريحة وساترة

لخلية الخد

  • خذ عود أسنان نظيف واكشط برفق داخل خدك
  • قم بإعداد حامل مبلل كما في الخطوات 2-6. بدلاً من ذلك ، استخدم محلول الميثيلين الأزرق كصبغة

الانقسام والانقسام الاختزالي الجزء ب

Petra Vyplelová Miroslav Ovečka George Komis Jozef Šamaj، in Methods in Cell Biology، 2018

4.4 تصوير صفائف الأنابيب الدقيقة للنبات مع نظام المسح الضوئي المتحد البؤر للنقاط مع دقة محسّنة

يمثل الفحص المجهري للمسح بالليزر المتحد البؤر (CLSM) المجهز بنظام Airyscan تطبيقًا جديدًا لنهج التصوير بمسح النقاط بدقة محسنة. تم تجهيز النظام بكاشف 32 GaAsP يوفر حساسية عالية وقدرة فائقة على جمع الضوء. يمكن فحص العينات باستخدام الوضع السريع الذي يسمح بدقة زمنية كافية أثناء الاستحواذ المكاني والزمني ثلاثي الأبعاد. بدلاً من ذلك ، يمكن استخدام وضع الدقة العالية للسماح بتحسين الدقة ثلاثية الأبعاد للحصول على واحدة ض- أكوام. مع الأخذ في الاعتبار هذه التحسينات التقنية ، استخدمنا منصة الفحص المجهري LSM880 Airyscan (Carl Zeiss Microscopy) لتوثيق التقدم الانقسامي في خلايا ktn1-2 متحولة تعبر بشكل ثابت عن علامة الأنبوب الدقيق GFP-TUA6 (Komis et al. ، 2017). عيوب في تنظيم صفائف الأنابيب الدقيقة الانقسام في الخلايا المنقسمة الناجمة عن طفرة في كاتانين 1 تم توثيق الجين بشكل واضح بالمقارنة مع عنصر التحكم المقابل (الشكل 3).

تين. 3 . تحليل مقارن لصفائف الأنابيب الدقيقة أثناء الانقسام والحركة الخلوية لخلايا البشرة سويقات الأوراق في نبات الأرابيدوبسيس thaliana النباتات تحولت بثبات مع 35S :: GFP: TUA6 بناء بين النباتات البرية والطفرة بالضربة القاضية ktn1-2، ناقص في الأنابيب الدقيقة التي تقطع بروتين KATANIN 1 باستخدام الفحص المجهري بالليزر المتحد البؤر المجهز بنظام Airyscan. تنظيم صفائف الأنابيب الدقيقة النموذجية لمراحل انقسام خلوي معينة في خلايا نبات من النوع البري (A و C و E) و ktn1-2 متحولة (ب ، د ، و). (A و B) تضييق نطاق الطور الأولي (PPB) في المرحلة المتأخرة من G2 من دورة الخلية (مرحلة ما قبل الطور). لاحظ الترتيب أحادي القطب وغير المنظم للأنابيب الدقيقة PPB في ktn1-2 متحولة (ب). (C و D) تنظيم المغزل الانقسامي ، لا يظهر أي تغييرات هيكلية بين التحكم و ktn1-2 خلايا متحولة. (E و F) تنظيم الأنابيب الدقيقة phragmoplast أثناء التحلل الخلوي. بالمقارنة مع السيطرة (E) ، فإن phragmoplast في ktn1-2 متحولة بشكل غير طبيعي (F). شريط النطاق: 5 ميكرومتر.

يتم تعقيم سطح الخطوط المعدلة وراثيًا التي تعبر عن علامة الأنابيب الدقيقة المناسبة (GFP-TUA6) باستخدام 70٪ (حجم / حجم) من الإيثانول لمدة دقيقتين متبوعًا بـ 1٪ (حجم / حجم) هيبوكلوريت الصوديوم الذي يحتوي على 0.05٪ (حجم / حجم) توين 20 لمدة 8 دقائق. بعد الغسل ، تُطلى البذور المعقمة على سطح وسط MS نصف القوة بدون فيتامينات وبنسبة 1٪ (وزن / حجم) سكروز ، درجة الحموضة معدلة إلى 5.7 ، مقواة بفيتاجيل بتركيز 0.6٪ (وزن / حجم). بعد التقسيم الطبقي للبذور عند 4 درجات مئوية لمدة 2-4 أيام ، يتم زراعتها في غرفة النمو عند 22 درجة مئوية ، ورطوبة 50٪ ، وفترة ضوئية 16/8 ساعة (الضوء / الظلام) في وضع عمودي للسماح بنمو الجذور مباشرة على سطح الوسط المتصلب.

أولاً ، من الضروري بناء غرفة المراقبة باستخدام شريحة زجاجية وساترة متباعدة مع بارافيلم أو شرائط شريط لاصق مزدوج. يتم وضع قطرة من وسط MS السائل نصف القوة في منتصف الشريحة ويتم نقل شتلة واحدة محددة إلى القطرة. العينة محصورة بين الشريحة والغطاء مع مسافة ثابتة لضمان مساحة كافية للشباب A. thaliana مصنع. يتم غلق الغرفة الصغيرة على الجوانب والحواف بواسطة شرائط بارافيلم لمنع تبخر وسط MS السائل نصف القوة أثناء التصوير بفاصل زمني لأكثر من ساعة واحدة. ملحوظة: يجب أن يتم نقل النباتات المختارة من وسط الاستزراع إلى شريحة الفحص المجهري في ظل ظروف معقمة في صندوق التدفق الصفحي.

Epidermal petiole cells of young first true leaf are suitable for observation of cell division in the green part of A. thaliana النباتات. The most preferable plants are 6–7 days old for preparation of such sample. The plant must be entirely covered by the coverslip and young first true leaf must be positioned by abaxial (lower) leaf side parallel to the coverslip.

The example given here ( Fig. 3 ) was obtained using LSM880 with Airyscan (Carl Zeiss Microscopy). We used single-photon excitation with the 488 nm laser line and a 32 GaAsP detector for fluorescence detection. The superior light-collecting capacity of the Airyscan and the sensitivity of the GaAsP detector allowed setting laser power to a level not exceeding 2% of the range available. Observation of dividing cells was done with Plan-Apochromat 63 ×/1.4 NA oil immersion objective and data sets were analyzed with Zeiss Zen 2014 software (Blue Version).


Dataset of microscopic images before and after staining? - مادة الاحياء


This training process is to train the statistical color detection model based on visual selected color pixels. You can start training by selecting a Region of Interest (ROI) through a rectangular tool in imageJ and pressing Training button on main panel.

The left image is original DAB stained color image and the right image is the result image. Using the sliding bar presented in sub-panel (color Chooser), you can visually determine the reserved color pixels in the result image. Once all the desired color pixels of an image are reserved, you can record them by pressing Collection button in color Chooser panel. The model is then automatically calculated and created. In general, the training phase requires re-selecting the ROI on multiple training samples in order to obtain a wide range of shades of the target color. You can close the collected image and re-open a new one. When a new training image is added, the model is then re-calculated automatically based on the accumulated histograms.

At the end of collecting training samples, the created statistical model can be saved (Using Save Model button in color Chooser panel) and reused for subsequent detection. It is recommended to save the model as the .txt format. Please see those models we created in the Modelfolder. These model files are pre-defined color model for the detection of DAB stained brown color, brown color in elastin contained liver samples and Sirius Read (SR) stained pink color. Users can define their own models throung the Training step and put them in User Model folder.

By selecting those models or changing a new one, you can press the button Read User Model on the main panel to read them one by one. The Read Model button is set to read the default model H-DAB.txt for brown color detection.


Once you have read one color detection model (for example, the H-DAB. txt), simply press the Color button on the main panel. Then the tool will generate the detected result in a created new window.


For the nuclei segmentation and quantification, you can set those parameters before you press Nuclei button. The quantification consists of counting the positive nuclei and oval fitted nuclei segmentation. Instead, the contour is drawn at the edge of the detected positive nuclei. Unless customized parameters are set, this nuclei segmentation and quantification functions are automatically processed. Changing between the processes of Quantification to Segmentation, you can select the order through the drop-down menu.
In order to estimate the parameters for nuclei segmentation, you can use the square tool and ellipse tool in imageJ. The image on the left is fitted by a 44x44 square, and the image on the right is fitted by an ellipse that has 908 pixels inside. For the window size parameter, it is better to set as 25 pixels (half size of the window) which may cover the sizes of all nuclei. And the seed size, corresponding to the minimum size constraint, should be the half of small nucleus. In our dataset, the size of nuclei changes from 300 to 900 pixels, where we set 150 pixels as seed size.


شاهد الفيديو: طريقة عزل الغطاء النباتي NDVI في برنامج الايرداس 2014 شرح عربي (شهر نوفمبر 2022).