معلومة

الوحدة 9: أنماط النمو البكتيري - بناء ثقافات المخزون الخاص بك ومراقبة خصائص الثقافة - علم الأحياء

الوحدة 9: أنماط النمو البكتيري - بناء ثقافات المخزون الخاص بك ومراقبة خصائص الثقافة - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

الوحدة 9: أنماط النمو البكتيري - بناء ثقافات المخزون الخاص بك ومراقبة خصائص الثقافة

الوحدة 9: أنماط النمو البكتيري - بناء ثقافات المخزون الخاص بك ومراقبة خصائص الثقافة - علم الأحياء

ناتاليا ، امرأة حامل تبلغ من العمر 24 عامًا في الثلث الثاني من حملها ، تزور عيادة لديها شكاوى من ارتفاع درجة الحرارة ، 38.9 درجة مئوية (102 درجة فهرنهايت) ، والتعب ، وآلام في العضلات - علامات وأعراض تشبه أعراض الأنفلونزا. تمارس ناتاليا الرياضة بانتظام وتتبع نظامًا غذائيًا مغذيًا مع التركيز على الأطعمة العضوية ، بما في ذلك الحليب الخام الذي تشتريه من سوق المزارعين المحليين. جميع تحصيناتها محدثة. ومع ذلك ، فإن مقدم الرعاية الصحية الذي يرى ناتاليا يشعر بالقلق ويطلب عينة دم ليتم اختبارها من قبل مختبر علم الأحياء الدقيقة.

سنعود إلى مثال ناتاليا في الصفحات اللاحقة.

تتضمن دورة الخلية البكتيرية تكوين خلايا جديدة من خلال تكرار الحمض النووي وتقسيم المكونات الخلوية إلى خليتين ابنتيتين. في بدائيات النوى ، يكون التكاثر دائمًا لاجنسيًا ، على الرغم من حدوث إعادة تركيب جيني واسع النطاق في شكل نقل جيني أفقي ، كما سيتم استكشافه في فصل مختلف. تحتوي معظم البكتيريا على كروموسوم دائري واحد ، ولكن توجد بعض الاستثناءات. على سبيل المثال، بوريليا برغدورفيرية، العامل المسبب لمرض لايم ، لديه كروموسوم خطي.


كيف تنمو البكتيريا وأكثر

إذا كنت تتعلم كيفية زراعة البكتيريا ، فاقرأ.

نظرة عامة على البكتيريا

البكتيريا هي كائنات دقيقة وحيدة الخلية أو أحادية الخلية. وهي تختلف عن الخلايا النباتية والحيوانية لأنها لا تحتوي على نواة مميزة ومغلقة بالغشاء تحتوي على مادة وراثية. بدلاً من ذلك ، يطفو الحمض النووي الخاص بهم في تشابك داخل الخلية. هي الفيروسات المحتجين؟

لا يمكن رؤية البكتيريا الفردية إلا بالمجهر ، لكنها تتكاثر بسرعة كبيرة لدرجة أنها غالبًا ما تشكل مستعمرات يمكننا رؤيتها. تتكاثر البكتيريا عندما تنقسم خلية واحدة إلى خليتين من خلال عملية تسمى الانشطار الثنائي. يحدث الانشطار النووي بسرعة في أقل من 20 دقيقة. في ظل الظروف المثالية ، يمكن لبكتيريا واحدة أن تنمو لتصبح أكثر من مليار بكتيريا في 10 ساعات فقط! (إنه أمر جيد نادرًا ما تكون الظروف الطبيعية مثالية ، أو ستدفن الأرض في البكتيريا!)

تعد زراعة البكتيريا واختبارها مشروعًا ممتعًا في أي وقت أو مشروعًا علميًا رائعًا. البكتيريا موجودة في كل مكان ، وبما أنها تتكاثر بسرعة فمن السهل دراستها باستخدام القليل من المواد البسيطة. كل ما تحتاجه هو بعض أطباق بتري وأجار ومسحات معقمة أو إبرة تلقيح. Agar هو وسيط هلامي يوفر العناصر الغذائية وبيئة مستقرة وخاضعة للرقابة لنمو البكتيريا (محلول أجار). تنمو معظم البكتيريا بشكل جيد باستخدام أجار المغذيات ، ولكن بعض البكتيريا الأكثر حساسية (تلك التي لديها متطلبات غذائية أكثر تعقيدًا مثل Bacillus stearothermophilus, Branhamella catarrhalis، و تجلط العصيات) تفضل أجار الصويا المربى.

أنت أيضًا بحاجة إلى مصدر للبكتيريا ، وليس من الصعب العثور عليه! يمكنك مسح فمك أو جلدك أو الحيوانات الأليفة أو التربة أو الأسطح المنزلية مثل حوض المطبخ أو حوض المرحاض. إذا كنت ترغب في دراسة نوع معين من البكتيريا ، يمكنك أيضًا شراء مزارع حية في قسم الأحياء الدقيقة للأطفال. استمر في القراءة لترى أربع تجارب باستخدام البكتيريا والمزيد من الأفكار للمشاريع العلمية (ضع في اعتبارك أيضًا هذه المجموعة العملية لزراعة البكتيريا)! يوصى بإشراف الكبار عند العمل مع البكتيريا.

كيف يمكن أن تساعدنا البكتيريا؟

أين سنكون بدون بكتيريا؟ حسنًا ، قد لا نصاب بأمراض بكتيرية ، لكننا سنظل أسوأ بكثير! تؤدي البكتيريا جميع أنواع الوظائف المهمة جدًا ، سواء في أجسامنا أو في العالم من حولنا. هنا ليست سوى عدد قليل.

الهضم. أمعاءنا الغليظة مليئة بالبكتيريا المفيدة التي تكسر الطعام الذي تستطيع أجسامنا هضمه بمفردها. بمجرد أن تتحلل البكتيريا ، تصبح أمعائنا قادرة على امتصاصها ، مما يمنحنا المزيد من العناصر الغذائية من طعامنا.

فيتامينات. تنتج البكتيريا الموجودة في الأمعاء وتفرز الفيتامينات المهمة لصحتنا! على سبيل المثال، بكتريا قولونية تعد البكتيريا الموجودة في أمعائنا مصدرًا رئيسيًا لفيتامين ك بكتريا قولونية مفيد لنا ، لكن هناك نوع ضار يسبب التسمم الغذائي.)

طعام. تستخدم البكتيريا لتحويل الحليب إلى زبادي وجبن ومنتجات ألبان أخرى.

الأكسجين. تعيش البكتيريا الزرقاء (التي كانت تسمى الطحالب الخضراء المزرقة) في الماء وتقوم بعملية التمثيل الضوئي ، مما يؤدي إلى إنتاج الكثير من الأكسجين الذي نحتاجه للتنفس.

تنظيف. انسكاب النفط ، ومياه الصرف الصحي ، والنفايات الصناعية - يمكن للبكتيريا أن تساعدنا في تنظيف كل هذه الأشياء! إنهم & # 8216eat & # 8217 الزيت أو السموم ويحولونها إلى مواد أقل ضررًا.

البكتيريا مخلوقات مذهلة ، أليس كذلك؟ يمكن أن تكون خطيرة جدًا ولكنها مهمة جدًا في نفس الوقت. استمر في القراءة لترى تجربة تستخدم بكتيريا جيدة!

كيف يمكن للبكتيريا أن تؤذينا؟

تسبب بعض أنواع البكتيريا المرض والمرض. تسمى هذه الأنواع من البكتيريا مسببات الأمراض. تتكاثر بسرعة كبيرة ، مثل كل البكتيريا. تأتي هذه في أشكال عديدة ويمكن أن تسبب أمراضًا من عدوى الأذن إلى التهاب الحلق إلى الكوليرا. يمكنهم الوصول إلى أجسادنا عن طريق الفم والأنف أو من خلال الجروح والخدوش. بعضها محمول في الهواء ، والبعض الآخر موجود في الطعام ، مما يؤدي إلى التسمم الغذائي. تسبب البكتيريا أيضًا تراكم الترسبات على أسناننا ، مما قد يؤدي إلى تسوس الأسنان وأمراض اللثة.

قبل اكتشاف المضادات الحيوية ، لم يكن هناك علاج للعديد من الأمراض البكتيرية الشديدة وعادة ما تؤدي إلى الوفاة. تعمل المضادات الحيوية عن طريق تدمير البكتيريا أو منع تكاثرها مع ترك خلايا الجسم دون أن يصاب بأذى. بعد فترة من الوقت ، تطور بعض البكتيريا مقاومة للمضادات الحيوية ، ولن تكون فعالة ضدها. لهذا السبب ، يبحث العلماء دائمًا عن مضادات حيوية جديدة. (العديد من الأمراض ، مثل جدري الماء ، والتهاب الكبد ، وشلل الأطفال ، تسببها الفيروسات وليس البكتيريا. وليس للمضادات الحيوية أي تأثير ضد هذه الأمراض).

تعد العدوى البكتيرية شائعة ، ولكن يمكن تجنب الكثير منها عن طريق الطهي الجيد والتنظيف وغسل اليدين.

ما هي العوامل المضادة للبكتيريا؟

كيف يمنع الناس البكتيريا من النمو والانتشار؟ إنهم يسيطرون عليه بطريقتين: عن طريق قتل خلايا البكتيريا ، ومنع البكتيريا من التكاثر. العامل هو حل أو طريقة تقتل أو توقف التكاثر. مبيدات الجراثيم هي عوامل تقتل خلايا البكتيريا. العوامل الساكنة تمنع نمو الخلايا وتكاثرها.

هناك عدة طرق لقتل البكتيريا أو منعها من التكاثر.

  • تعقيم. استخدام الحرارة لقتل البكتيريا. يشمل الحرق والغليان والطبخ.
  • بسترة. استخدام حرارة معتدلة لتقليل عدد البكتيريا في الطعام.
  • درجات الحرارة الباردة. يعد التبريد والتجميد من أكثر الطرق شيوعًا المستخدمة في المنازل ، للحفاظ على الطعام وعمر الخدمة # 8217.
  • المطهرات. يمكن تطبيق هذه العوامل مباشرة على الأنسجة الحية ، بما في ذلك جلد الإنسان.
  • المطهرات. هذه العوامل ليست آمنة للأنسجة الحية. تستخدم المطهرات لتنظيف المراحيض والأحواض والأرضيات وما إلى ذلك.
  • مواد حافظة. تُستخدم في كل الأطعمة المصنعة المتوفرة اليوم تقريبًا. أنها تمنع نمو البكتيريا في الأطعمة.
    • بعض المواد الحافظة للأغذية هي بنزوات الصوديوم ، وغلوتامات أحادية الصوديوم (MSG) ، وثاني أكسيد الكبريت ، والأملاح ، والسكر ، ودخان الخشب.
    • Amoxycillin و Ampicillin - يثبطان خطوات تخليق جدار الخلية (المبنى)
    • البنسلين - يثبط خطوات تخليق جدار الخلية
    • الاريثروميسين - يثبط ترجمة الحمض النووي الريبي لتخليق البروتين

    ملاحظة السلامة

    في حين أن معظم البكتيريا البيئية ليست ضارة بالأفراد الأصحاء ، إلا أنها بمجرد تركيزها في المستعمرات ، يمكن أن تكون خطرة.

    لتقليل المخاطر ، قم بارتداء القفازات التي تستخدم لمرة واحدة أثناء التعامل مع البكتيريا ، واغسل يديك جيدًا قبل وبعد. لا تأكل أو تشرب أبدًا أثناء دراسات البكتيريا ، ولا تستنشق أو تبتلع الثقافات النامية. العمل في غرفة خالية من تيار الهواء وتقليل تدفق الهواء قدر الإمكان. احتفظ بأطباق بتري ذات الأوساط المزروعة مغلقة - ويفضل أن تكون مغلقة بشريط لاصق - ما لم يتم أخذ العينات أو التطهير. حتى مع ذلك ، قم بإزالة طبق بتري بما يكفي فقط لإدخال معدتك أو غطاء الوسط بالمبيض أو 70٪ كحول الأيزوبروبيل.

    عند الانتهاء من التجربة ، أغلق الأطباق في كيس بلاستيكي وتخلص منها. قم بتغطية الكسور العرضية أو الانسكابات بالمبيض أو الكحول لمدة 10 دقائق ، ثم كنسها بعناية وإغلاقها في كيس بلاستيكي والتخلص منها.

    تحضير أطباق الثقافة

    قبل أن تتمكن من زراعة البكتيريا ، تحتاج & # 8217ll لإعداد أطباق ثقافة معقمة. زجاجة 125 مل من أجار المغذيات تحتوي على ما يكفي لملء حوالي 10 أطباق بتري.

    طريقة حمام الماء & # 8211 قم بفك غطاء زجاجة أجار ، لكن لا تقم بإزالته تمامًا. ضع الزجاجة في ماء ساخن عند درجة حرارة 170-190 درجة فهرنهايت حتى يصبح كل الآجار سائلاً. لمنع الزجاجة من الانقلاب ، حافظ على مستوى الماء حتى مع مستوى أجار.

    • دع الأجار يبرد إلى 110-120 درجة فهرنهايت (عندما لا تزال الزجاجة دافئة ولكن ليست ساخنة جدًا للمس) قبل صبها في أطباق بتري.
    • افتح غطاء طبق بتري بما يكفي لصب أجار في الطبق. صب ما يكفي من الآجار لتغطية 1/2 إلى 2/3 من قاع الطبق (حوالي 10-13 مل). لا تدع فم الزجاجة يلمس الطبق. قم بتغطية الطبق فورًا لمنع التلوث وقم بإمالة الطبق للأمام والخلف برفق حتى يغطي الأجار قاع الطبق بالكامل. (املأ العديد من الأطباق التي لديك أجار من أجل: يمكنك تخزين الإضافات رأسًا على عقب حتى تصبح جاهزًا لاستخدامها.)
    • دع أطباق بتري تقف لمدة ساعة حتى يتصلب الأجار قبل استخدامها.

    التجربة رقم 1: مسحة خلية الخد

    اصنع طبقًا ثقافيًا باستخدام التعليمات المذكورة أعلاه. بمجرد تحضير طبق المزرعة ، استخدم قطعة قطن معقمة أو إبرة تلقيح وامسح داخل خدك. افرك المسحة برفق على الأجار في بضع ضربات متعرجة واستبدل غطاء الطبق. ستحتاج إلى ترك الطبق في مكان دافئ لمدة 3-7 أيام قبل ظهور نمو البكتيريا. سجل النمو كل يوم برسم ووصف مكتوب. البكتيريا الفردية صغيرة جدًا بحيث لا يمكن رؤيتها بدون مجهر عالي الطاقة ، ولكن يمكنك رؤية مستعمرات البكتيريا. يميز بين أنواع البكتيريا المختلفة من خلال لون وشكل المستعمرات.

    التجربة رقم 2: اختبار العوامل المضادة للبكتيريا

    تحضير مربعات الحساسية

    تتمثل إحدى طرق اختبار الفعالية المضادة للبكتيريا لمادة ما في استخدام مربعات الحساسية & # 8216. & # 8217 قطع مربعات صغيرة من ورق النشاف (أو ورق ماص آخر) ثم نقعها في أي مادة تريد اختبارها: اليود ، والكحول الإيثيلي ، صابون مضاد للجراثيم ، مطهرات ، ثوم ، إلخ. استخدم ملاقط نظيفة للتعامل مع المربعات حتى لا تلوثها. قم بتسميتها بالحبر الدائم ، وانقعها في المادة المختارة ، وامسح السائل الزائد بمنشفة ورقية.

    جمع البكتيريا

    حدد مصدرًا لجمع البكتيريا. لاستخدام مربعات الحساسية ، تأكد من وجود مصدر واحد فقط ، وحافظ على تناسق كل طبق قدر الإمكان. يمكن أن تشمل المصادر حوض المطبخ أو منضدة الحمام أو الهاتف الخلوي أو أي سطح آخر ترغب في اختباره. افرك مسحة معقمة على السطح المختار ، ثم افركها برفق عبر طبق الأجار المحضر بنمط متعرج. قم بتدوير الطبق وكرر الأمر.

    إعداد تجربة

    يجب أن تحتوي كل تجربة على طبق تحكم يوضح نمو البكتيريا في ظل الظروف العادية وطبق اختبار واحد أو أكثر يمكنك فيه تغيير بعض المتغيرات وفحص النتائج. من أمثلة المتغيرات التي يجب اختبارها درجة الحرارة أو وجود المطهرات. كيف تؤثر هذه على نمو البكتيريا؟

    • قم بتسمية طبق واحد & # 8216Control. & # 8217 ثم في طبق الاختبار الخاص بك ، استخدم الملقط لإضافة مربعات الحساسية التي تم نقعها في مادة ترغب في اختبار خصائصها المضادة للبكتيريا. من الجيد إضافة مربع عادي من ورق النشاف لمعرفة ما إذا كان الورق بحد ذاته له أي تأثير على نمو البكتيريا. للحصول على أفضل النتائج ، استخدم أطباق اختبار متعددة وتحكم في المتغيرات بحيث تكون الظروف متطابقة لكل طبق: البكتيريا التي يتم جمعها من نفس المكان ، والمعرضة لنفس الكمية من المادة المضادة للبكتيريا ، والمخزنة في نفس درجة الحرارة ، وما إلى ذلك. كلما زادت البيانات التي ستجمعها ، وكلما زادت ثقتك في استنتاجاتك.
    • ضع جميع الأطباق في مكان مظلم بدرجة حرارة الغرفة مثل الخزانة.

    انتظر من 3 إلى 7 أيام وافحص نمو البكتيريا في الأطباق دون إزالة الغطاء. سترى عدة نقاط مستديرة للنمو هذه مستعمرات بكتيرية. اعتمادًا على المكان الذي جمعت فيه عينات البكتيريا ، قد يكون لديك عدة أنواع من البكتيريا (وحتى بعض العفن!) تنمو في أطباقك. سيكون للأنواع المختلفة من المستعمرات ألوان وأنسجة مختلفة. إذا كان لديك مجهر مركب أو مجسم ، فحاول النظر إلى المستعمرات عن قرب لترى المزيد من الاختلافات.

    قارن عدد البكتيريا في طبق التحكم بالكمية الموجودة في أطباق الاختبار. بعد ذلك ، قارن بين كمية البكتيريا التي تنمو حول كل مربع ورقي. أيهما أقرب للبكتيريا؟ أيهما يحتوي على أقل كمية من البكتيريا تنمو بالقرب منه؟ إذا قمت بإجراء أكثر من طبق اختبار ، فهل النتائج متشابهة في جميع أطباق الاختبار؟ إذا لم يكن الأمر كذلك ، فما المتغيرات التي تعتقد أنها تسببت في اختلاف النتائج؟ كيف يؤثر هذا على استنتاجاتك؟

    للحصول على اختلاف في هذه التجربة ، اختبر تأثير درجة الحرارة على نمو البكتيريا بدلاً من استخدام مربعات الحساسية. ضعي طبق تحكم في درجة حرارة الغرفة ، وضعي الأطباق الأخرى في مناطق مظلمة بدرجات حرارة مختلفة.

    التجربة رقم 3: مسح الصابون

    في كل مرة تلمس شيئًا من المحتمل أنك تلتقط بكتيريا جديدة وتترك بعضها وراءك. هذا هو عدد الأمراض المعدية التي تنتشر - نشارك البكتيريا لدينا مع كل من حولنا! حتى البكتيريا التي تعيش بأمان على جلدنا يمكن أن تجعلنا مرضى إذا دخلت أجسامنا من خلال أفواهنا أو جروحنا وخدوشنا. هذا أحد أسباب أهمية غسل أيدينا بشكل متكرر وبصورة جيدة.

    أي نوع من الصابون يعمل بشكل أفضل لتقليل البكتيريا الموجودة على أيدينا؟ يمكنك اختبار ذلك عن طريق زراعة بعض الثقافات البكتيرية باستخدام أطباق الأجار والبتري.

    • اثنان (أو أكثر) من أطباق بتري أو أوراق أو ملاقط ماصة أخرى
    • أنواع مختلفة من منظفات الأيدي: صابون عادي ، صابون مضاد للبكتيريا ، صابون أطباق ، معقم لليدين
    1. قم بإعداد الأجار وفقًا للإرشادات الموجودة على الملصق ، ثم اسكب كمية كافية لتغطية قاع كل طبق بتري. قم بتغطية الأطباق واتركها تقف لمدة ساعة تقريبًا حتى يتجمد الأجار مرة أخرى. (إذا لم تكن & # 8217t ستستخدمها على الفور بعد أن تبرد ، فقم بتخزينها رأسًا على عقب في الثلاجة.)
    2. عندما تصبح أطباق بتري جاهزة ، اجمع بعض البكتيريا من يدك أو من يد أحد المتطوعين. (تأكد من أن الشخص لم يغسل يديه مؤخرًا!) افعل ذلك عن طريق فرك المسحة المعقمة على راحة اليد في نمط متعرج.
    3. قم بإزالة الغطاء من طبق بتري وافرك المسحة برفق ذهابًا وإيابًا في نمط متعرج على أجار. اقلب الطبق ربع لفة وتعرج مرة أخرى. غطي الطبق وكرر الخطوتين الثانية والثالثة للطبق الآخر باستخدام مسحة معقمة جديدة. قم بتسمية الأطباق & # 8220Test & # 8221 و & # 8220Control. & # 8221 (قد ترغب في عمل أكثر من طبق اختبار ، حتى تتمكن من مقارنة النتائج.)
    4. قص الورق النشاف إلى مربعات حساسية صغيرة & # 8220. & # 8221 استخدم الحبر الدائم لتسمية المربعات لأنواع مختلفة من منظفات الأيدي التي ستختبرها ، على سبيل المثال ، & # 8220R & # 8221 للصابون العادي ، & # 8220A & # 8221 للصابون المضاد للبكتيريا ، و & # 8220S & # 8221 لمطهر اليدين. باستخدام الملقط ، اغمس كل مربع في المنظف المناسب. امسح المنظف الزائد على منشفة ورقية ثم ضع المربعات على الأجار في & # 8220Test & # 8221 الطبق. (انشر المربعات بحيث تكون هناك مسافة بينها.) أضف مربعًا واحدًا من ورق النشاف العادي لاختبار ما إذا كان للورق النشاف في حد ذاته أي تأثير. لا تضع أي مربعات في & # 8220Control & # 8221 الطبق & # 8211 هذا سيوضح لك كيف سيبدو نمو البكتيريا بدون أي صابون.
    5. ضع الأطباق في مكان مظلم بدرجة حرارة الغرفة مثل الخزانة واتركها دون إزعاج لبضعة أيام.

    ماذا حدث

    يعتمد معدل نمو البكتيريا في أطباقك على درجة الحرارة وعوامل أخرى. تحقق من ثقافاتك بعد يومين ، لكنك & # 8217ll ربما تريد الانتظار 5-7 أيام قبل تسجيل بياناتك. سترى عدة نقاط مستديرة للنمو هذه مستعمرات بكتيرية. قد يكون هناك عدة أنواع من البكتيريا تنمو في الأطباق. سيكون للأنواع المختلفة من المستعمرات ألوان وأنسجة مختلفة.

    لكل اختبار صابون ، قم بعد وتسجيل عدد مستعمرات البكتيريا في كل طبق. لمعرفة مدى فعالية كل صابون ، قسّم عدد الخلايا في طبق الاختبار على عدد الخلايا في طبق التحكم ، ثم اطرح النتيجة من 1 واكتب الإجابة كنسبة مئوية. على سبيل المثال ، إذا كان طبق التحكم الخاص بك يحتوي على 100 خلية وكان طبق اختبار الصابون يحتوي على 30 ، فإن الصابون يقضي على 70٪ من البكتيريا: 1 - (30 ÷ 100) = .7 = 70٪

    وفقًا لنتائجك ، ما هو نوع الصابون الأكثر فعالية في القضاء على البكتيريا؟ هل يعمل الصابون & # 8220 المضاد للبكتيريا & # 8221 حقًا أفضل من الصابون العادي؟ ما مدى نجاح غسل اليدين بالماء بدون صابون؟ ما الاختبارات الإضافية التي يمكنك إجراؤها لتحديد أنواع الصابون وطرق غسل اليدين الأكثر فعالية في القضاء على البكتيريا؟

    التجربة رقم 4: البكتيريا في الهواء

    أنت بحاجة إلى طبقين مستنبتين لهذه التجربة ، حيث ستوضح & # 8217ll كيف تؤثر العوامل المضادة للبكتيريا (مثل المضادات الحيوية والمنظفات المنزلية) على نمو البكتيريا.

    اترك الأطباق مع غطائها في مكان بدرجة حرارة الغرفة. اترك أطباق الثقافة مكشوفة لمدة ساعة تقريبًا.

    أثناء الانتظار ، قم بقص مربعات صغيرة من الورق (يعمل ورق النشاف جيدًا) ، وقم بتسميتها بأسماء مضادات البكتيريا التي ستختبرها & # 8217re (على سبيل المثال & # 8216L & # 8217 لـ Lysol ، & # 8216A & # 8217 للكحول ، إلخ. ) ، ونقع كل منها في مادة كيميائية منزلية مختلفة ترغب في اختبارها لخصائصها المضادة للبكتيريا. إذا كان لديك الوقت ، يمكنك أيضًا تجربة العوامل الطبيعية المضادة للبكتيريا ، مثل زيت شجرة الشاي أو الفلفل الأحمر. امسح أي سائل زائد واستخدم الملقط لوضع كل مربع في مكان مختلف في أحد أطباق الثقافة. طبق الاستنبات الثاني هو & # 8216 التحكم. & # 8217 سيُظهر لك كيف تبدو ثقافة بكتيريا الهواء بدون أي عوامل كيميائية.

    قم بتخزين الأطباق (مع الأغطية) في مكان مظلم مثل الخزانة حيث لن يتم إزعاجها لبضعة أيام. بعد 3-7 أيام ، تناول كلا طبق المزرعة ولاحظ بعناية نمو البكتيريا في كل طبق ، مع ترك الأغطية. ستكون البكتيريا مرئية في مجموعات صغيرة ملونة. قم بتدوين ملاحظاتك وقم بعمل رسومات. يمكنك أيضًا الإجابة على الأسئلة التالية.في ثقافة التحكم ، ما مقدار الطبق المغطى بالبكتيريا؟ في مزرعة اختبار مربع الحساسية ، هل غطت البكتيريا هذا الطبق بنفس درجة ثقافة التحكم؟ ما هو تأثير كل مادة كيميائية على نمو البكتيريا؟ هل تقتل مادة كيميائية معينة البكتيريا أو تمنع نموها فقط؟

    • لمزيد من الدراسة ، يمكنك استخدام مجموعة أقراص مضاد حيوي لمعرفة ما يمكن أن تفعله المضادات الحيوية المختلفة ضد البكتيريا.
    • للحصول على مشروع أكثر تقدمًا ، تعرف على كيفية ارتباط تلطيخ الجرام باستخدام المضادات الحيوية.

    التجربة رقم 5: الزبادي منزلي الصنع

    بشكل عام ، عندما يفكر الناس في & # 8216bacteria ، & # 8217 ، فإنهم يفكرون في الجراثيم الضارة. ومع ذلك ، ليست كل أنواع البكتيريا ضارة!
    يمكنك الاستمتاع بمنتج لذيذ من البكتيريا الجيدة عن طريق صنع مجموعة من الزبادي في المنزل.

    ستحتاج إلى استخدام مقبلات (متوفرة في محلات البقالة أو الأطعمة الصحية) ، أو كوب واحد من الزبادي العادي غير المنكه الذي يحتوي على ثقافات حية فيه. (إذا كان يحتوي على ثقافات حية ، فسيظهر ذلك على الحاوية.)

    سخني أربعة أكواب من الحليب ببطء حتى يصبح ساخنًا ، لكن دون غليان أو احتراق. يجب أن تكون درجة الحرارة حوالي 95-120 درجة لقتل بعض البكتيريا الضارة. تبرد قليلاً ، حتى يصبح الحليب دافئاً ، ثم يضاف كوب من الزبادي النشط أو المقبلات.

    ضعي الخليط في وعاء كبير (أو برطمانات زجاجية) وغطيه. تأكد من تعقيم الوعاء أو البرطمانات قبل الاستخدام إما عن طريق تمريرها في غسالة الأطباق أو غسلها بالماء الساخن جدًا.

    هناك طريقتان مختلفتان لزراعة خليط الزبادي: يمكنك وضع الوعاء أو البرطمانات المغطاة في مبرد بلاستيكي نظيف ، وملء المبرد بالماء الساخن أسفل أعلى أوعية الاستنبات. بهذه الطريقة ، سوف تحتاج إلى إعادة ملء المبرد بالماء الساخن من حين لآخر ، حتى تظل درجة حرارة الزبادي ثابتة. الطريقة الأخرى هي لف الحاويات في وسادة تدفئة ومناشف ، ووضع وسادة التدفئة على حرارة منخفضة إلى متوسطة.

    افحص الخليط بعد التسخين لمدة 3 1/2 إلى 4 ساعات. يجب أن يكون & # 8216 جاهزًا ، & # 8217 أن يكون قوامه ناعمًا ودسمًا مشابهًا للزبادي الذي يتم شراؤه في المتجر. إذا لم يتم إعداد الخليط بعد ، قم بتسخينه لمدة 1-2 ساعة أخرى. عندما يكون القوام مناسبًا ، أضف بعض النكهات - مثل مستخلص الفانيليا أو شراب الشوكولاتة أو التوت - وقم بتخزين الزبادي في الثلاجة. يجب أن تبقى لمدة أسبوعين. للسلامة ، نقترح عدم تناول أي زبادي منفصل أو يحتوي على قوام غير معتاد.


    تصنيف وسائط الثقافة البكتيرية على أساس الغرض / الاستخدام الوظيفي / التطبيق

    الآجار المغذي

    هناك حاجة إلى العديد من الوسائط ذات الأغراض الخاصة لتسهيل التعرف على أنواع معينة من البكتيريا وتعدادها وعزلها. لتلبية هذه الاحتياجات ، تتوفر العديد من الوسائط.

    هدف عام وسائط

    الوسائط القاعدية التي تسمى أيضًا وسائط الأغراض العامة هي في الأساس وسائط بسيطة تدعم نمو معظم البكتيريا غير الحساسة. تعتبر مياه الببتون ومرق المغذيات وأجار المغذيات (NA) من الوسائط القاعدية. تستخدم هذه الوسائط بشكل عام للعزل الأولي للكائنات الحية الدقيقة.

    الإعلام المخصب

    إضافة العناصر الغذائية الزائدة على شكل دم ، مصل ، صفار البيض ، إلخ ، إلى الوسط القاعدي يجعل وسطًا غنيًا. تستخدم الوسائط المخصبة لنمو البكتيريا (شديدة الحساسية) من الناحية التغذوية. أجار الدم ، وأجار الشوكولاتة ، ومنحدر مصل Loeffler ، وما إلى ذلك هي بعض الأمثلة على الوسائط الغنية. يتم تحضير أجار الدم بإضافة 5-10٪ (بالحجم) من الدم إلى قاعدة أجار الدم. أجار الشوكولاتة يُعرف أيضًا باسم أجار الدم الساخن أو lysed أجار الدم.

    الإعلام الانتقائي والإثرائي

    تم تصميم هذه الوسائط لمنع البكتيريا المتعايشة أو الملوثة غير المرغوب فيها والمساعدة على استعادة مسببات الأمراض من خليط من البكتيريا. في حين أن الوسائط الانتقائية تعتمد على أجار ، فإن وسائط التخصيب سائلة في الاتساق. كل من هذه الوسائط تخدم نفس الغرض. يمكن جعل أي وسائط أجار انتقائية عن طريق إضافة عوامل مثبطة معينة لا تؤثر على العامل الممرض المعني. تشمل الأساليب المختلفة لجعل الوسيط انتقائيًا إضافة المضادات الحيوية ، والأصباغ ، والمواد الكيميائية ، وتغيير الأس الهيدروجيني ، أو مزيج من هذه.

    انتقائي وسائط

    مبدأ: قمع النمو التفاضلي
    تم تصميم الوسط الانتقائي لقمع نمو بعض الكائنات الحية الدقيقة مع السماح بنمو أخرى. الوسط الانتقائي هو وسط (صلب) قائم على أجار بحيث يمكن عزل المستعمرات الفردية.

      تستخدم للتعافي النيسرية البنية يحتوي على مضادات حيوية فانكومايسين وكوليستين ونيستاتين.
  • مانيتول ملح أجار ويستخدم ملح الحليب أجار للتعافي بكتريا المكورة العنقودية البرتقاليةيحتوي على 10٪ كلوريد الصوديوم.
  • يستخدم وسط تيلوريت البوتاسيوم للتعافي جيم - الدفتيريا يحتوي على 0.04٪ تيلوريت بوتاسيوم المعويةتحتوي الأعضاء على ملح الصفراء الذي يثبط معظم البكتيريا موجبة الجرام. تستخدم للتعافي الزائفة الزنجارية يحتوي على سيتريميد (عامل مطهر).
  • يستخدم أجار الدم البنفسجي الكريستالي للتعافي S. المقيحة يحتوي على 0.0002٪ كريستال بنفسجي. تستخدم للتعافي م انتقائي من خلال دمج الأخضر الملكيت.
  • ويلسون وبلير أجار للتعافي S. typhi يتم تقديمه بشكل انتقائي بإضافة صبغة خضراء لامعة.
  • وسائط انتقائية مثل TCBS أجارتستخدم للعزل ضمة الكوليرا من عينات البراز لديها درجة حموضة مرتفعة (8.5-8.6) ، مما يثبط معظم البكتيريا الأخرى.
  • وسائط الإثراء

    يستخدم وسط التخصيب لزيادة التركيز النسبي لبعض الكائنات الحية الدقيقة في المزرعة قبل الطلاء على وسط انتقائي صلب. على عكس الوسائط الانتقائية ، عادة ما تستخدم ثقافة الإثراء كوسيط مرق. وسائط التخصيب هي وسائط سائلة تعمل أيضًا على تثبيط التعايش في العينة السريرية. مرق السيلينيت F ، مرق رباعي ، و مياه الببتون القلوية (APW) تستخدم لاستعادة مسببات الأمراض من عينات البراز.

    التفاضل / المؤشر الوسيطأ

    تم تصميم بعض الوسائط بطريقة يمكن من خلالها التعرف على البكتيريا المختلفة على أساس لون مستعمرتها. تشمل الأساليب المختلفة دمج الأصباغ ، وركائز التمثيل الغذائي ، وما إلى ذلك ، بحيث تظهر تلك البكتيريا التي تستخدمها كمستعمرات مختلفة الألوان. تسمى هذه الوسائط الوسائط التفاضلية أو وسائط المؤشر. تسمح الوسائط التفاضلية بنمو أكثر من كائن حي دقيق واحد مهم ولكن مع مستعمرات يمكن تمييزها شكليًا.

    تتضمن أمثلة الوسائط التفاضلية ما يلي:

      (تخمير المانيتول = أصفر) (أنواع مختلفة من انحلال الدم ، أي α و β و γ انحلال الدم)
    1. ماك كونكي أجار(تخمير اللاكتوز ، المستعمرات الوردية ، بينما ينتج التخمير غير اللاكتوز مستعمرات شاحبة أو عديمة اللون.
    2. TCBS(ضمة الكوليرا ينتج مستعمرات صفراء بسبب تخمر السكروز)

    وسائط النقل

      ووسيط Venkatraman Ramakrishnan (VR) لنقل البراز من مرضى الكوليرا المشتبه بهم.
    • يستخدم محلول الجلسرين الملحي المخزن من ساش لنقل البراز من المرضى المشتبه في إصابتهم بالزحار العصوي.
    • يستخدم وسط بايك لنقل العقديات من عينات الحلق.

    الوسائط اللاهوائية:

    تحتاج البكتيريا اللاهوائية إلى وسائط خاصة للنمو لأنها تحتاج إلى محتوى أكسجين منخفض وإمكانية تقليل الأكسدة ومغذيات إضافية.

    قد يلزم تكميل وسائط اللاهوائية بالعناصر الغذائية مثل الهيمين وفيتامين ك. وقد يتعين أيضًا تقليل هذه الوسائط بالوسائل الفيزيائية أو الكيميائية. يعمل غليان الوسط على طرد أي أكسجين مذاب. يمكن أن تؤدي إضافة 1٪ جلوكوز ، 0.1٪ ثيوجليكولات ، 0.1٪ حمض أسكوربيك ، 0.05٪ سيستين ، أو برادة حديد ساخن أحمر إلى تقليل الوسط. قبل الاستخدام ، يجب غلي الوسط في حمام مائي لطرد أي أكسجين مذاب ثم ختمه ببارافين سائل معقم.

    اللحوم المطبوخة روبرتسون (RCM) الوسط الذي يشيع استخدامه للنمو المطثية يحتوي spp على عمود 2.5 سم من لحم قلب الثور و 15 مل من مرق المغذيات. يحتوي مرق ثيوجليكولات على ثيوجليكولات الصوديوم والجلوكوز والسيستين وخلاصة الخميرة والكازين المائي.

    الميثيلين الأزرق أو ريسازورين هو مؤشر محتمل للحد من الأكسدة مدمج في الوسط. في ظل حالة مخفضة ، يكون الميثيلين الأزرق عديم اللون.


    مقايسة لوحة الجراثيم: المبدأ ، الإجراء ، النتائج

    نظرًا لأن العالم يكافح مع مشاكل زيادة مقاومة مضادات الميكروبات ، فإن العديد من الأبحاث جارية لتقييم تطبيقات العاثيات لعلاج الالتهابات البكتيرية (كبديل للعلاج بالمضادات الحيوية).

    تم تطوير استخدام العاثيات لعلاج الالتهابات البكتيرية في عشرينيات وثلاثينيات القرن الماضي في أوروبا الشرقية والاتحاد السوفيتي.

    اختبار البلاك هو أحد الأساليب المستخدمة على نطاق واسع لتحديد كمية الفيروس المعدي في العينة. يمكن فقط فحص الفيروسات التي تسبب ضررًا مرئيًا للخلايا بهذه الطريقة. تم تطوير اختبار البلاك لأول مرة لحساب عيارات مخزون البكتيريا. حاليًا ، يتم استخدام الإجراء المعدل لتحديد عيار العديد من فيروسات الحيوانات المختلفة أيضًا.

    مبدأ فحص Phage Plaque

    عندما ينتشر تعليق الملتهمة المعدية (على سبيل المثال T4 فج) على العشب من الخلايا البكتيرية الحساسة (على سبيل المثال الإشريكية القولونية)، تعلق العاثية الخلية البكتيرية ، وتتكاثر بداخلها ، وتقتلها أثناء إطلاقها الليلي. يشار إلى تحلل البكتيريا عن طريق تكوين منطقة تطهير أو لوحة داخل عشب البكتيريا. في غياب العاثية اللايتية ، تشكل البكتيريا عشبًا متكدسًا للنمو.

    تتوافق كل لوحة مع الموقع الذي عملت فيه عاثية واحدة كوحدة معدية وبدأت دورة التحلل. يؤدي انتشار العاثية المعدية من الخلية البكتيرية المصابة في البداية إلى الخلايا المحيطة إلى تحلل البكتيريا في المنطقة المجاورة ، مما يؤدي في النهاية إلى تكوين طبقة كبيرة بما يكفي لتكون مرئية للعين المجردة. لا تستمر اللويحات في الانتشار إلى أجل غير مسمى. يعتمد حجم اللويحة المتكونة على الفيروس والمضيف وظروف الاستنبات.

    يمكن استخدام عدد اللويحات التي تتطور وعوامل التخفيف المناسبة لحساب عدد العاثيات ، أي
    وحدات تشكيل البلاك (PFU) في عينة.

    يحتوي الوسيط المستخدم في فحوصات لوحة الملتهمة على نسبة منخفضة نسبيًا من أجار ، وبالتالي يتم استدعاؤه أجار ناعم يسمح بانتشار الملتهمة إلى الخلايا غير المصابة القريبة ولكنه لا يسمح بالعاقمات الجديدة بالانتقال إلى الأجزاء البعيدة من اللوحة.

    إجراء فحص الجراثيم البلاك

    فحص الجراثيم البلاك

    تحضير محلول المخزون بالتخفيف التسلسلي

    1. ضع ثمانية أنابيب ملحية معقمة (0.9 مل لكل منها) في رف أنبوب الاختبار.
    2. قم بتسمية أنبوب واحد "تحكم" وقم بتسمية الأنابيب الخمسة المتبقية على التوالي من 10 -1 إلى 10 -7.
    3. تسمية ستة لوحات أجار المغذيات نفس الأنابيب.
    4. باستخدام ماصة معقمة سعة 1 مل ، انقل بطريقة معقمة 0.1 مل من معلق ملوثات البكتيريا المقدمة إلى أنبوب المحلول الملحي المسمى 10-1.
    5. امزج الأنبوب جيدًا عن طريق لفه بين راحتي يديك.
    6. باستخدام ماصة أخرى سعة 1 مل ، انقل 0.1 مل من الأنبوب 10-1 إلى أنبوب 10 -2. امزج الأنبوب.
    7. باستخدام ماصة جديدة لكل عملية نقل ، انقل 0.1 مل من المعلق من الأنبوب 10 -2 إلى الأنبوب 10 -3 ، واستمر في إجراء التخفيف على التوالي للأنابيب الملحية المتبقية. لا تنس أن تخلط كل أنبوب جيدًا قبل التخفيف وبعده.

    تراكب لوحة مع خليط Phage-Agar

    1. (ملاحظة: يجب أن تعمل هنا بسرعة) احصل على ستة أنابيب من أجار تراكب ناعم ذائب من الحمام المائي. ماصة 0.3 مل من ثقافة مرق بكتريا قولونية في كل أنبوب من أنابيب الآجار الناعمة. امزج كل أنبوب جيدًا عن طريق لفه بين راحتي يديك. قم بتسمية كل أنبوب بالأحرف الأولى من اسمك وأعده إلى الحمام المائي في أقرب وقت ممكن. لا تسمح للأجار أن يصلب.
    2. (العمل بسرعة مرة أخرى) قم بإزالة أنبوب واحد من الأجار الناعم من الحمام المائي. امسح كل الماء من على سطح الأنبوب. باستخدام ماصة 1 مل ، ونقل جو معقم و مطهر 0.1 مل من 10-1 التخفيف من الملوحة الملحية في أنبوب أجار الناعم. امزج أنبوب أجار عن طريق لفه بين يديك.
    3. على الفور ، قم بصب الأجار الناعم بطريقة معقمة ومعقم على سطح لوحة أجار المغذيات المسمى بالمقابل 10-1. استبدل الغطاء وبدون التقاط اللوحة ، قم بتدويره برفق في دائرة من 6 إلى 8 بوصات على سطح الطاولة لتوزيع الأجار بالتساوي.
    4. باستخدام ماصة جديدة سعة 1 مل في كل مرة والعمل بسرعة ، كرر الخطوتين 1 و 2 لأنابيب التخفيف الملحية المتبقية وأنبوب التحكم في محلول ملحي.
    5. لكل أنبوب تخفيف ، استخدم طبق أجار المغذيات الخاص به.
    6. السماح للأجار الناعم بالتصلب.
    7. قلب واحتضان اللوحات عند 35 درجة مئوية إلى 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

    نتائج

    1. بعد فترة الحضانة ، افحص كل لوحة واحسب عدد اللويحات على كل لوحة التي تحتوي على لويحات متمايزة بوضوح.
    2. سجل التهم الخاصة بك. يجب تسجيل اللوحات التي غطت اللوحات فيها الصفيحة بأكملها وحيث لا يمكن تمييز اللوحات بوضوح عن بعضها البعض (أكثر من 300 لوحة) على أنها TNTC (كثيرة جدًا بحيث لا يمكن عدها).
    3. احسب عدد العاثيات اللاكتاتية لكل مليلتر التي كانت في التعليق الأصلي لعاثيات البكتيريا باستخدام الصيغة المذكورة أعلاه.

    نتائج فحص البلاك الجراثيم

    إذا لوحظ وجود 48 لويحة في عامل التخفيف 10-5 ، عند إضافة فيروس 0.1 مل ، ستكون وحدات تكوين البلاك / مل 4.8 × 10 7.


    ما الذي يمكن أن ينمو على طبق أجار المغذيات؟

    بكتيريا

    يجب أن تمثل كل مستعمرة دائرية مميزة خلية أو مجموعة بكتيرية فردية انقسمت بشكل متكرر. عند الاحتفاظ بها في مكان واحد ، تتراكم الخلايا الناتجة لتشكل رقعة مرئية. تظهر معظم المستعمرات البكتيرية بيضاء أو قشدية أو صفراء اللون ودائرية إلى حد ما.

    العصوية الرقيقة (3)
    بروتيوس فولغاريس (4)
    المكورات العنقودية (5)
    العقدية المقيحة (6)

    الخميرة

    الخميرة ، نوع من الفطريات (جمع الفطريات) ، توجد في العديد من الأماكن من الطبيعة ، إلى مختبرات البحث وحتى المطابخ اليومية للخبز. تبدو مستعمرات الخميرة بشكل عام مماثلة للمستعمرات البكتيرية. بعض الأنواع مثل الكانديدا، يمكن أن تنمو كبقع بيضاء ذات سطح لامع.

    المبيضات البيض) هو نوع من الخميرة يمكن أن ينمو على سطح الجلد(7)
    مستعمرات الخميرة الدائرية(8)
    مستعمرات الخميرة الوردية(9)

    قوالب

    القوالب هي في الواقع فطريات ، وغالبًا ما تظهر باللون الرمادي المائل إلى البياض ، مع حواف غير واضحة. عادة ما يتحولون إلى لون مختلف ، من المركز إلى الخارج. يتم عرض مثالين من القوالب أدناه:

    العفن الأخضر (Trichoderma harzianum)(10)
    العفن الأسود (Aspergillus nidulaus)(11)

    الفطريات الأخرى

    يمكن أن تعزى مستعمرات الطحالب الخضراء أو السحابة البيضاء أو حلقة من الجراثيم إلى نمو فطر الرشاشيات، وهو أمر شائع في حالات العدوى الفطرية مثل قدم الرياضي. هنا مثال على ماذا فطر الرشاشيات يشبه:


    أنواع الوسائط:

    تتطلب نمو الكائنات الحية الدقيقة مغذيات وظروف بيئية. تسمى المستحضرات الغذائية المصنوعة في المختبر والمستخدمة لنمو الكائن الحي بالوسائط (المفرد: متوسط). يتم استخدام ثلاثة أشكال فيزيائية: الوسائط السائلة أو الوسائط شبه الصلبة والوسائط الصلبة. يمكن استخدام الوسائط السائلة ، مثل مرق المغذيات أو مرق الصويا التجريبي أو مرق ضخ قلب الدماغ ، لنشر أعداد كبيرة من الكائنات الحية الدقيقة في دراسات التخمير والاختبارات الكيميائية الحيوية. يمكن أيضًا استخدام الوسائط شبه الصلبة في دراسات التخمير ، وفي تحديد الحركة البكتيرية ، وفي تعزيز النمو اللاهوائي. يتم استخدام الوسائط الصلبة ، مثل أجار المغذيات أو أجار الدم ، للنمو السطحي للكائنات الحية الدقيقة من أجل مراقبة مظهر المستعمرة ، (2) لعزل المستنبتات النقية ، (3) تخزين الكثير من الثقافات ، و (4) لمراقبة الكيمياء الحيوية المحددة تفاعلات. أثناء وجوده في الحالة المسالة ، يمكن سكب الوسائط الصلبة إما في أنبوب اختبار أو طبق بتري (طبق) وإذا تم سكب الأجار في طبق بتري ، يتم تعيين اللوحة على أنها لوحة أجار.


    بروتوكول

    1. جهز مساحة عمل آمنة ومعقمة

    كن على دراية بجميع قواعد المختبر واحتياطات السلامة التي يجب اتخاذها عند العمل مع الكائنات الحية الدقيقة. بغض النظر عن تصنيف الخطر البيولوجي ، تعتبر جميع المواد التي تتلامس مع الكائنات الحية الدقيقة نفايات معدية ويجب تطهيرها قبل التخلص منها. اتبع إرشادات السلامة وفقًا للإرشادات المقدمة من إدارات الصحة والسلامة البيئية المؤسسية ، وقم بإعداد أوعية نفايات مناسبة للتخلص الفوري والسليم من المواد التي يحتمل أن تكون ملوثة (المخاطر البيولوجية).

    تعقيم جميع الأدوات والحلول والوسائط قبل استخدامها في إجراءات الطلاء.

    قم بإزالة جميع المواد التي تشوش منطقة عملك على طاولة المختبر.

    نظف منطقة العمل بالمطهر لتقليل التلوث المحتمل.

    قم بإعداد موقد بنسن واعمل ببطء وحذر وعمد داخل منطقة الحقل المعقمة التي تم إنشاؤها بواسطة تيار اللهب الصاعد.

    إذا كنت تعمل مع كائنات BSL-2 ، فقم بإعداد مساحة عملك في خزانة السلامة الحيوية. لا يمكن استخدام موقد بنسن داخل الخزانة لأن الحرارة المنبعثة من اللهب تعطل تدفق الهواء الضروري لوظائفها.

    قم بترتيب جميع المستلزمات اللازمة للإجراء على طاولة المختبر بالقرب من الحقل المعقم. تأكد من تسمية جميع المواد بشكل صحيح. إن تنظيم منطقة العمل لزيادة كفاءة العمل إلى أقصى حد وتجنب الحركات غير الضرورية سيقلل من وقت تعرض المواد التجريبية للملوثات المحمولة جواً.

    ضع موقد بنسن على يمينك على المقعد.

    ضع أطباق أجار أو أطباق بتري على يسارك.

    رتب مزارع الخلايا والأنابيب والقوارير والزجاجات في وسط المقعد.

    قم بفك أغطية الأنابيب والقوارير والزجاجات حتى يمكن فتحها بسهولة بيد واحدة أثناء التلاعب اللاحق.

    اغسل يديك جيدًا بالصابون المطهر والماء الدافئ قبل التعامل مع الكائنات الحية الدقيقة.

    2. إجراء لوحة الخط: عزل المستعمرات البكتيرية باستخدام طريقة الربع

    تم تصميم إجراء لوحة الخطوط لعزل الثقافات النقية للبكتيريا ، أو المستعمرات ، من المجموعات المختلطة عن طريق الفصل الميكانيكي البسيط. تتكون المستعمرات المفردة من ملايين الخلايا التي تنمو في كتلة على أو داخل صفيحة أجار (شكل 1). المستعمرة ، على عكس الخلية الواحدة ، تكون مرئية للعين المجردة. من الناحية النظرية ، يتم اشتقاق جميع الخلايا في مستعمرة من بكتيريا واحدة ترسبت في البداية على الصفيحة ، وبالتالي يشار إليها على أنها استنساخ ، أو مجموعة من الخلايا المتماثلة وراثيًا.

    توجد البكتيريا في مجموعة متنوعة من الأشكال والأحجام. على سبيل المثال ، الفرد الإشريكية القولونية الخلايا على شكل قضيب بمتوسط ​​طول 2 & # x003bcm وعرض 0.5 & # x003bcm بينما العقدية تكون الخلايا كروية بمتوسط ​​قطر يبلغ 1 & # x003bcm. بعض البكتيريا (مثل بكتريا قولونية) موجودة كخلايا مفردة بينما يشكل الآخرون أنماطًا مميزة من الارتباط. العقدية، على سبيل المثال ، تنمو في أزواج أو تشكل سلاسل أو مجموعات من الخلايا. يُفترض عمومًا أن مستعمرة واحدة تنشأ من خلية واحدة تخضع للانشطار الثنائي ، ومع ذلك ، فإن هذا الافتراض غير صحيح بالنسبة لتلك البكتيريا الموجودة بشكل طبيعي كأزواج أو سلاسل أو مجموعات أو التي تنقسم بواسطة آليات أخرى. بدلاً من ذلك ، إذا تم طلاء عدد كبير جدًا من البكتيريا ، فقد يحدث تداخل في الخلايا ويزيد من احتمال ظهور نوعين أو أكثر من البكتيريا مما يبدو أنه مستعمرة واحدة. لتجنب هذه المضاعفات عند وصف أو تعداد الثقافات البكتيرية التي تنمو على وسط صلب ، يشار إلى المستعمرات باسم وحدات تشكيل مستعمرة (cfu).

    باستخدام إجراء لوحة الخط ، ينتشر خليط من الخلايا على سطح وسط مغذي شبه صلب ، قائم على أجار في طبق بتري بحيث يتم ترسيب عدد أقل وأقل من الخلايا البكتيرية في نقاط منفصلة على نطاق واسع على سطح الوسط وبعد الحضانة ، تتطور إلى مستعمرات. سيتم وصف الطريقة الرباعية لعزل المستعمرات المفردة من خليط من الخلايا هنا.

    يمكن تحقيق الطلاء الخطي باستخدام عدد من الأدوات المختلفة (الشكل 2). يمكن إعادة استخدام الحلقة المعدنية عدة مرات ويتم استخدامها لطلاء السلالات المختبرية الروتينية. الحلقات البلاستيكية التي يمكن التخلص منها متاحة تجاريًا وتستخدم بشكل أكثر شيوعًا عند العمل مع سلالات BSL-2 في خزانة السلامة الحيوية. يفضل العديد من العلماء استخدام أعواد خشبية معقم مسبقًا أو أعواد أسنان مسطحة لطلاء الخطوط. هذه بديل غير مكلف للحلقات البلاستيكية التي يمكن التخلص منها ويمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص عند العمل مع عينة بيئية مثل التربة التي من المحتمل أن تحتوي على بكتيريا مكونة للجراثيم.

    لا يلزم حرق العصي وأعواد الأسنان المعقمة مسبقًا بموقد بنسن ، وبالتالي منع الهباء الجوي غير الضروري للبكتيريا المكونة للأبواغ والتلوث المتبادل لأسطح المختبرات أو ألواح الآجار مع الجراثيم.

    ضع علامة حول حافة الجزء السفلي (وليس الغطاء) لصفيحة أجار مع ذكر اسمك على الأقل والتاريخ ونوع وسيط النمو ونوع الكائن الحي المراد طلاءه على الوسط.

    يجب أن تكون الألواح جافة تمامًا بدون تكاثف على الغطاء وأن يتم تسخينها مسبقًا لدرجة حرارة الغرفة قبل الطلاء بالخطوط. إذا تم تخزين اللوحات في 4 & # x000b0C ، فقم بإزالتها عدة ساعات أو حتى في اليوم السابق. انشرها في أكوام صغيرة متداخلة لا تزيد عن 2-3 أطباق واتركها تجف.

    يمكن أن تكون العينة التي سيتم تلقيح لوحة الخط منها إما تعليق الخلايا في المرق أو مستعمرة موجودة من لوحة أجار أخرى. للبدء ، يوصى باستخدام عينة واحدة فقط لتلقيح صفيحة واحدة. لتوفير الوقت والمواد ، يمكن استخدام لوحة واحدة لعينات متعددة ولكن فقط بمجرد أن تصبح بارعًا في رسم عينة واحدة على لوح.

    بالنسبة للربع الأول ، يتم التقاط العينة وتوزيعها على حوالي ربع سطح الوسط باستخدام حركة سريعة وسلسة ذهابًا وإيابًا (اللوحة A من الشكل 3). ارفع النصف السفلي من اللوحة المقلوبة من على المقعد. حرك الحلقة أو العصا أو عود الأسنان للخلف وللأمام عدة مرات عبر سطح الأجار من الحافة إلى مركز اللوحة.

    إذا كان اللقاح عبارة عن تعليق خلية ، فاحصل على حلقة مع حلقة معدنية أو من 5 إلى 10 & # x003bcl باستخدام مرشح ميكرو. تأكد من تحريك أو دوامة تعليق الخلية قبل إزالة قسامة للطلاء. استخدم تقنية التعقيم أثناء تنفيذ هذه الخطوة ، حيث لا تشعل الحلقة فقط ولكن أيضًا حافة الزجاجة أو الأنبوب قبل وبعد إزالة اللقاح. أيضًا ، لا تلمس جوانب الأنبوب أو الزجاجة بحلقة أو ماسورة المرشح الصغير. إذا تم سحب اللقاح ، فقم بتوزيع تعليق الخلية على المكان المناسب على اللوحة ثم استخدم حلقة أو عصا أو عود أسنان لتوزيعه على الربع الأول من اللوحة.

    إذا كان اللقاح مستعمرة من صفيحة أخرى ، فالمس المستعمرة بلطف بالحلقة أو العصا أو عود الأسنان ثم انشرها فوق الربع الأول من اللوحة. تأكد من تبريد الحلقة المعدنية قبل لمس المستعمرة. للتأكد من أن الحلقة ليست ساخنة للغاية ، المسها برفق على لوحة أجار في منطقة معينة حيث لن يحدث أي خط. هناك حاجة إلى عدد قليل من الخلايا من المستعمرة ، وليس المستعمرة بأكملها.

    في حالة استخدام حلقة معدنية ، قم بإشعالها باستخدام موقد بنسن قبل الحصول على اللقاح الخاص باللوحة (اللوحة B من الشكل 3). ابدأ بحوالي 3-4 بوصات من الحلقة ، مع وجود السلك في طرف المخروط الأزرق ، وهو الجزء الأكثر سخونة من اللهب. يجب أن يصبح المعدن أحمر حار. حرك السلك بحيث يقترب اللهب من الحلقة. يمنع هذا التلاعب رذاذ البكتيريا المتروكة على الحلقة من الاستخدام السابق.

    يقتل اللهب البكتيريا (وإن لم يكن الأبواغ) ، كما أن التيارات الحرارية من الهواء الساخن تمنع الملوثات الأخرى المحمولة جواً من الاستقرار على السلك المعدني أثناء التلاعب اللاحق.

    إذا كنت تستخدم مسواكًا مسطحًا معقمًا ، أمسك الطرف الضيق برفق بين إصبعك الإبهام والبنصر بزاوية 10 إلى 20 & # x000b0 إلى الوسط ، واستخدم الطرف العريض لخط الأرباع. إذا كنت تستخدم حلقة أو عصا خشبية ، فامسكها كقلم رصاص بنفس الزاوية. لا تضغط بشدة بحيث تحفر الحلقة أو العصا أو المسواك في الأجار.

    بعد الانتهاء من الربع الأول ، اقلب اللوحة واضبطها مرة أخرى في الغطاء على المقعد. تخلص من العصا أو عود الأسنان أو أعد إشعال الحلقة المعدنية كما هو موضح في الخطوة رقم 4.

    اقلب طبق بتري 90 & # x000b0 لخط الربع الثاني. ارفع النصف السفلي من الصفيحة المقلوبة من المقعد ثم المس الحلقة أو العصا أو عود الأسنان بالربع الأول بالقرب من نهاية الخط الأخير. باستخدام نمط ذهابًا وإيابًا ، اعبر النصف الأخير من الخطوط في الربع الأول ثم انتقل إلى الربع الثاني الفارغ. اقلب اللوحة واضبطها مرة أخرى في الغطاء على المقعد بمجرد ملء الربع الثاني.

    يجب ألا تعود الحلقة أو العصا أو المسواك أبدًا إلى النصف الأول من الخطوط في الربع الأول حيث تم إيداع معظم اللقاح الأصلي.

    يجب استخدام حلقة بلاستيكية جديدة أو عصا خشبية أو عود أسنان لكل ربع.

    كرر الخطوة رقم 6 مرتين للربعين الثالث والرابع.

    تأكد من التخلص من العصا أو عود الأسنان أو إعادة إشعال الحلقة المعدنية بين كل ربع.

    تجنب الخوض في الربع الأول عند تسليط الضوء على الربع الرابع.

    احضن الصفيحة رأسًا على عقب حتى لا يتساقط التكثيف الذي يتراكم على الغطاء على المستعمرات.

    3. صب الإجراء لوحة: تعداد الخلايا البكتيرية في عينة مختلطة

    غالبًا ما تُستخدم هذه الطريقة لحساب عدد الكائنات الحية الدقيقة في عينة مختلطة ، والتي تتم إضافتها إلى وسط أجار منصهر قبل تصلبها. ينتج عن العملية مستعمرات موزعة بشكل موحد في جميع أنحاء الوسط الصلب عندما يتم تخفيف العينة المناسبة. تُستخدم هذه التقنية لأداء عدد الصفائح القابلة للتطبيق ، حيث يتم تعداد العدد الإجمالي لوحدات تشكيل المستعمرة داخل الأجار وعلى سطح الأجار على لوحة واحدة. توفر أعداد الصفائح القابلة للتطبيق للعلماء وسيلة معيارية لتوليد منحنيات النمو ، لحساب تركيز الخلايا في الأنبوب الذي تم طلاء العينة منه ، وللتحقق من تأثير البيئات المختلفة أو ظروف النمو على بقاء الخلية البكتيرية أو معدل نموها.

    ضع علامة حول حافة الجزء السفلي (وليس الغطاء) لطبق بتري معقم ولكنه فارغ مع ذكر على الأقل اسمك والتاريخ ونوع وسيط النمو ونوع الكائن الحي المراد إضافته إلى وسط الأجار الذائب.

    قم بتضمين عامل التخفيف في حالة الطلاء التخفيفات المتسلسلة، أو سلسلة من التخفيفات المتكررة ، مما يؤدي إلى انخفاض منهجي في تركيز الخلايا في العينة. يعد إعداد التخفيفات التسلسلية أمرًا ضروريًا إذا كان عدد الخلايا في العينة يتجاوز سعة لوحة أجار ، حيث يتراوح النطاق المهم إحصائيًا من 30 إلى 300 قدم مكعب. إذا كان هناك أكثر من 300 cfu على الطبق ، فستكون المستعمرات مزدحمة ومتداخلة.

    الحصول على أنبوب يحتوي على 18 مل من وسط أجار ذائب.

    يجب توزيع وسيط الأجار في أنابيب اختبار وتعقيمها مسبقًا في الأوتوكلاف. في نفس اليوم مطلوب لإجراء تجربة ، يجب صهر الأجار في قدر بخاري لمدة 30 دقيقة ثم نقله إلى حمام مائي 55 & # x000b0C. يجب صهر أجار فقط بقدر ما هو مطلوب للتجربة حيث لا يمكن إعادة استخدامه.

    قبل عشر دقائق من صب الألواح ، يجب نقل أنابيب الأجار الذائب من الحمام المائي 55 & # x000b0C إلى كتلة حرارية على طاولة المختبر عند 48 & # x000b0C. بمجرد أن يصل الأجار إلى درجة الحرارة هذه ، يصبح جاهزًا للصب. إذا كان الأجار ساخنًا جدًا ، فقد يتم قتل البكتيريا الموجودة في العينة. إذا كان الأجار باردًا جدًا ، فقد يكون الوسط متكتلًا بمجرد ترسيخه.

    احصل على عينتك ، والتي يجب أن تكون إما مزرعة مرق أو معلق للخلايا التي يتم إنتاجها عن طريق خلط الخلايا من مستعمرة إلى محلول أو محلول ملحي.

    يمكن اشتقاق العينات من سلسلة تخفيف لعينة واحدة.

    يجب أن يكون حجم العينة المراد طلاؤها بين 0.1 و 1.0 مل.

    افتح غطاء طبق بتري الفارغ ، ووزع العينة في منتصف الطبق (اللوحة A من الشكل 4). إغلاق الغطاء.

    استخدم تقنية التعقيم طوال هذا الإجراء.

    استخدم إما ماصة مصلية أو ماصة صغيرة لنقل العينة إلى اللوحة. تحكم في تدفق العينة حتى لا تتناثر خارج اللوحة.

    قم بإزالة الغطاء من أنبوب الأجار الذائب ، وقم بتمرير حافة الأنبوب المفتوح من خلال شعلة موقد بنسن.

    افتح غطاء طبق بتري الذي يحتوي على عينتك واسكب الأجار بعناية (اللوحة B من الشكل 4). أغلق الغطاء ثم اخلط العينة مع أجار عن طريق تحريك اللوحة برفق.

    اسمح للأجار أن يصلب تمامًا قبل قلب اللوحة للحضانة.

    4. إجراء لوحة الانتشار: تكوين المستعمرات البكتيرية المنفصلة لأعداد الصفائح أو الإثراء أو الاختيار أو الفرز

    تُستخدم هذه التقنية عادةً لفصل الكائنات الحية الدقيقة الموجودة في حجم عينة صغير ، والتي تنتشر على سطح صفيحة أجار ، مما يؤدي إلى تكوين مستعمرات منفصلة موزعة بالتساوي عبر سطح أجار عندما يتم طلاء التركيز المناسب للخلايا. بالإضافة إلى استخدام هذه التقنية في عدد الصفائح القابلة للتطبيق ، حيث يتم تعداد العدد الإجمالي لوحدات تشكيل المستعمرات على لوحة واحدة واستخدامها لحساب تركيز الخلايا في الأنبوب الذي تم طلاء العينة منه ، يتم استخدام طلاء الانتشار بشكل روتيني في تجارب الإثراء والاختيار والفرز. عادة ما تكون النتيجة المرجوة لهذه التجارب الثلاث هي نفسها بالنسبة لعدد الصفائح ، حيث يتشكل توزيع المستعمرات المنفصلة عبر سطح الأجار. ومع ذلك ، فإن الهدف ليس ضمان الكل خلايا قابلة للحياة تشكل مستعمرات. بدلاً من ذلك ، يجب أن تنمو فقط تلك الخلايا الموجودة ضمن مجموعة سكانية لها نمط وراثي معين. يمكن استخدام إجراء لوحة الانتشار على تقنية لوحة الصب لتجربة تعداد إذا كان الهدف النهائي هو عزل المستعمرات لمزيد من التحليل لأن المستعمرات تنمو بسهولة على سطح أجار بينما تصبح مدمجة في أجار باستخدام إجراء لوحة الصب.

    هناك استراتيجيتان موصوفتان هنا لإجراء لوحة الانتشار. تتضمن الطريقة الأولى (الطريقة أ) استخدام قرص دوار وقضيب زجاجي أو معدني على شكل عصا هوكي. أما الطريقة الثانية (الطريقة ب) ، والتي يشار إليها باسم "طريقة كوباكابانا" ، فتتضمن هز خرزات زجاجية معقمة مسبقًا. كلاهما يسهل انتشار الخلايا عبر سطح أجار.

    الطريقة أ: طلاء منتشر بصينية دوارة وقضيب زجاجي أو معدني

    ضع علامة حول حافة الجزء السفلي (وليس الغطاء) لصفيحة أجار مع ذكر اسمك على الأقل والتاريخ ونوع وسيط النمو ونوع الكائن الحي المراد طلاءه على الوسط.

    قم بتضمين عامل التخفيف في حالة الطلاء التخفيفات المتسلسلة.

    يجب أن تكون الألواح جافة تمامًا دون تكاثف على الغطاء وأن يتم تسخينها مسبقًا لدرجة حرارة الغرفة قبل نشر الطلاء. إذا تم تخزين اللوحات في 4 & # x000b0C ، فقم بإزالتها عدة ساعات أو حتى في اليوم السابق. انشرها في أكوام صغيرة متداخلة لا تزيد عن 2-3 أطباق واتركها تجف.

    قم بتوسيط اللوحة على القرص الدوار (الشكل 5).

    احصل على عينتك ، والتي يجب أن تكون عبارة عن مزرعة مرق أو معلق للخلايا التي يتم إنتاجها عن طريق خلط الخلايا من مستعمرة إلى محلول أو محلول ملحي.

    يمكن اشتقاق العينات من سلسلة تخفيف لعينة واحدة.

    يجب أن يكون حجم العينة المراد طلاؤها بين 0.1 و 0.2 مل.

    افتح غطاء طبق بتري ، ووزع العينة على وسط الأجار. إغلاق الغطاء.

    استخدم تقنية التعقيم طوال هذا الإجراء.

    استخدم المرشح الصغير لنقل عينتك إلى الطبق. تحكم في تدفق العينة حتى لا تتناثر خارج اللوحة.

    اغمس القضيب الزجاجي أو القضيب المعدني (ويسمى أيضًا الموزعة) في دورق يحتوي على 70٪ (حجم / حجم) من الإيثانول.

    تنبيه: لا تغمس المبشرة الساخنة في دورق الكحول.

    يجب أن يلمس الإيثانول الجزء السفلي من الموزعة والبوصة الأولى من الجذع فقط.

    قم بتصفية الإيثانول الزائد وإشعاله عن طريق تمريره عبر شعلة موقد بنسن.

    يجب أن ينتقل اللهب بطول الموزعة والساق التي تلامس الإيثانول ثم تنطفئ بسرعة.

    إذا اشتعلت النيران في كأس الإيثانول ، فلا داعي للذعر! ضع غطاء زجاجي فوق الدورق ، والذي سيطفئ الحريق بسرعة.

    افتح غطاء لوحة أجار ، وأمسك الغطاء بيدك اليسرى بإبهامك وسبابتك. قم بتبريد الموزعة عن طريق ملامستها للأجار على طول الحافة بالقرب من الحافة.

    لا تلمس الأجار حيث تمت إضافة الخلايا. سوف تقتل الموزعة الساخنة الخلايا.

    باستخدام يدك اليسرى (مع الاستمرار في الضغط على غطاء لوحة الأجار) ، قم بتدوير القرص الدوار ببطء.

    على الرغم من أنه من الأفضل تجنب ذلك ، إذا كان يجب عليك وضع الغطاء لأسفل ، فضعه على سطح معقم داخل الحقل المعقم لموقد بنسن. مع وجود غطاء متجه لأعلى ، هناك فرصة أكبر للتلوث من حركات الأشياء أو اليدين ، مما يخلق تيارات هوائية تتسبب في نزول الكائنات الدقيقة وجزيئات الغبار إلى السطح الداخلي للغطاء.

    باستخدام يدك اليمنى ، أمسك الموزعة برفق على سطح الأجار وانشر العينة تدريجياً بالتساوي على اللوحة بأكملها. حرك الموزعة ذهابًا وإيابًا عبر اللوحة أثناء دوران القرص الدوار.

    اسمح للعينة بالامتصاص جيدًا (5 دقائق على الأقل) قبل قلب اللوحة للحضانة.

    الطريقة ب: طلاء الانتشار بخرزات زجاجية: "طريقة كوباكابانا"

    ضع علامة حول حافة الجزء السفلي (وليس الغطاء) لصفيحة أجار مع ذكر اسمك على الأقل والتاريخ ونوع وسيط النمو ونوع الكائن الحي المراد طلاءه على الوسط.

    قم بتضمين عامل التخفيف في حالة الطلاء التخفيفات التسلسلية.

    افتح غطاء لوحة أجار ، وأمسك الغطاء بيدك اليسرى بإبهامك وسبابتك. ثم افتح الأنبوب الزجاجي أو الزجاجة التي تحتوي على خرز زجاجي معقم مسبقًا. باستخدام يدك اليمنى ، قم بإشعال حافة الأنبوب أو الزجاجة ثم قم بتوزيع 10-12 حبة زجاجية معقمة على طبق أجار (الشكل 6). أغلق غطاء اللوحة ، واشعل حافة الأنبوب أو الزجاجة مرة أخرى قبل إعادة الغطاء ووضعه جانبًا.

    اسكب الخرزات برفق من الأنبوب أو الزجاجة على ارتفاع بضعة سنتيمترات فوق الأجار حتى لا ترتد الخرزات من طبق بتري.

    استخدم حبات زجاجية قطرها 4 مم. قم بتعقيمها في عبوات زجاجية أو أنابيب اختبار في الأوتوكلاف على درجة حرارة 121 & # x000b0C في الدورة الجافة (إعداد الجاذبية) لمدة 30 دقيقة.

    تتمثل إحدى مزايا استخدام الخرز بدلاً من الموزعة في عدم الحاجة إلى حاويات مفتوحة من الإيثانول للاشتعال المتكرر.

    افتح غطاء لوحة أجار ، وقم بتوزيع العينة على مركز الأجار. إغلاق الغطاء.

    استخدم تقنية التعقيم طوال هذا الإجراء.

    قسامة 100 إلى 150 & # x003bcl من العينة لكل لوحة. سيسهل هذا الحجم انتشار الخلايا. استخدم المرشح الصغير لنقل عينتك إلى الطبق. تحكم في تدفق العينة حتى لا تتناثر خارج اللوحة.

    انشر العينة عن طريق هز الخرز بلطف عبر سطح أجار 6 إلى 7 مرات. لضمان انتشار الخلايا بالتساوي ، استخدم حركة اهتزاز أفقية.

    لا تقم بتدوير الخرزات وإلا ستنتهي جميع الخلايا عند حافة اللوحة.

    تلميح: إذا تم إجراؤه بشكل صحيح ، فإن الإجراء يبدو مثل "هز الماراكاس".

    قم بتدوير اللوحة 60 & # x000b0 ثم هزها أفقيًا مرة أخرى 6 إلى 7 مرات.

    قم بتدوير اللوحة 60 & # x000b0 مرة ثانية ورجها أفقيًا مرة أخرى. الآن ، يجب أن تحقق انتشارًا متساويًا للخلايا عبر سطح أجار.

    عند الانتهاء من طلاء الانتشار ، يجب امتصاص العينة ويجب أن يكون سطح الأجار جافًا. صب الحبيبات الملوثة في دورق جمع ملحوظ يحتوي على 10٪ كلور مبيض.

    لا تتخلص من الخرز في سلة المهملات! سيتم شطف الخرزات المستخدمة وتعقيمها ، وإعادة تعقيمها لاستخدامها مرة أخرى.

    ملاحظة: إذا كان سطح أجار لا يزال رطبًا بعد الاهتزاز ثلاث مرات ، اترك اللوحة للجلوس لعدة دقائق للسماح للأجار بامتصاص السائل ، ثم كرر الخطوات من 4 إلى 6 حتى يظهر سطح اللوحة جافًا.

    اقلب اللوحة للحضانة.

    5. إجراء تراكب الآجار الناعم: تكوين لويحات لعزل وتعداد الملتهمة (فحص البلاك)

    تُستخدم هذه التقنية بشكل شائع لاكتشاف العاثية وتحديد حجمها ، أو الفيروسات البكتيرية التي يتراوح حجمها من 100 إلى 200 نانومتر. هناك حاجة إلى مجهر إلكتروني لرؤية جزيئات الملتهمة الفردية. ومع ذلك ، يمكن الكشف عن وجود جزيئات الملتهمة المعدية صفائح على طبق أجار (الشكل 7 أ). لا يمكن أن تتكاثر العاثيات خارج الخلايا البكتيرية المضيفة ، لذلك يتطلب التكاثر والكشف خلط العاثيات والخلايا المضيفة معًا قبل الطلاء. لإجراء تراكب الآجار الناعم ، يتم توزيع حجم صغير ، بشكل عام في النطاق من 50 & # x003bcl إلى 200 & # x003bcl ، في أنبوب يحتوي على حوالي 10 8 بكتيريا (خلايا مضيفة) موزعة بالتساوي في 2.5 -3.0 مل من الآجار الناعم (0.5 إلى 0.7٪ [وزن / حجم]) ، أجار المغذيات المذابة. يُسكب الخليط الناتج على سطح صفيحة أجار صلبة (1.5 إلى 1.9٪ [وزن / حجم]). يتم هز اللوح بشكل كافٍ لضمان أن الأجار الناعم يغطي كامل سطح الأجار الصلب. ثم يتم وضع اللوحة على سطح مستو حتى تتاح لطبقة الأجار العلوية الوقت لتصلب ويمكن وضعها لاحقًا في الحاضنة.

    بمرور الوقت ، يُشار إلى تعليق غائم للخلايا البكتيرية ، باسم a العشب، يصبح مرئيًا في جميع أنحاء وسط أجار ناعم (الشكل 7 ب). تتشكل اللويحات إذا أصابت العاثية إحدى الخلايا البكتيرية ، وتتكاثرت داخل الخلية ، ثم تفرز الخلية التي تطلق ما يصل إلى 100 من العاثيات الذرية (ويعرف أيضًا باسم ال حجم الاندفاع). تنتشر جزيئات العاثيات الجديدة في الأجار الناعم ، وتصيب البكتيريا في المنطقة المحيطة بالخلية البكتيرية المتحللة. بعد دورات متعددة من العدوى والتحلل ، يختفي تعليق الخلية البكتيرية المعكر في الأجار الناعم ، تاركًا منطقة إزالة تسمى اللويحة. تحتوي كل لوحة على أكثر من 10 9 جسيمات فج ، جميعها متطابقة وراثيًا مع جسيم الملتهمة الأصلي. نظرًا لأن اللويحة تنشأ من جسيم فج واحد ، فإن العدد الناتج من وحدات تشكيل البلاك (pfu) قد تحسب والتركيز الأصلي ، أو عيار، من تعليق الملتهمة. يوفر هذا النوع من التجارب ، المسمى اختبار البلاك ، للعلماء أيضًا وسيلة معيارية لتوليد منحنيات نمو من خطوة واحدة ، والتحقيق في خصوصية نطاق المضيف ، وتحويل الخلايا البكتيرية للتجارب الجينية.

    تحضير البكتيريا المؤشر: يجب إعداد ثقافة متزايدة بشكل أسي لسلالة المضيف البكتيري لتجربة تراكب أجار الناعم. كل مضيف له متطلبات النمو الخاصة به. بين 0.3 مل و 0.5 مل من معلق بكتيريا المؤشر مطلوب لكل لوح. إذا تم تحضير قارورة من بكتيريا المؤشر (على سبيل المثال ، 25 مل) ، فيجب تقسيم الثقافة إلى قسامات أصغر (على سبيل المثال ، قسامات 5 مل يتم توزيعها في أنابيب معقمة مغطاة ببراغي) لتقليل احتمالية التلوث المتبادل.يمكن الاحتفاظ بالأنابيب على الجليد (عند 4 & # x000b0C) حتى تصبح جاهزة للاستخدام في التجربة. استخدم تقنية التعقيم لتلقيح مرق المغذيات المعقمة ثم احتضانها حسب مواصفات السلالة البكتيرية. يجب التخلص من بقايا الثقافات في نهاية اليوم.

    تحضير أنابيب الامتزاز: ضع اثنين من أنابيب الطرد المركزي المعقم في رف. قم بتسمية غطاء الأنبوب الأول "Phage" وغطاء الأنبوب الثاني "Control".

    عادة التخفيفات المتسلسلة من محلولات الملتهمة يتم تحضيرها ومطليها وفي هذه الحالة يتم إضافة أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الإضافية إلى الرف ويتم تمييزها بعامل التخفيف.

    يجب أن تكون مخزونات العاثيات طازجة من لويحات مفردة وتخزينها في 4 & # x000b0C. لتفكيك جزيئات الملتهمة ، يجب تسخين المخزونات إلى درجة الحرارة المحيطة قبل إجراء التجربة.

    يجب التعامل مع مخزون العاثيات برفق - لا تستخدم الدوامة أو الماصة بقوة.

    أضف 50 & # x003bcl من عينة الملتهمة إلى الأنبوب الأول ثم أضف 50 & # x003bcl من عازلة فج إلى الأنبوب الثاني ، والذي سيكون بمثابة عنصر تحكم سلبي لمقايسة البلاك.

    استخدم تقنية التعقيم في جميع عمليات التلاعب بالعاثية والبكتيريا.

    بعد ذلك ، أضف 500 & # x003bcl من بكتيريا المؤشر إلى كل أنبوب امتصاص.

    تستقر الخلايا البكتيرية في قاع الأنبوب إذا جلست على الجليد أو المقعد لفترات طويلة من الزمن. إذا لم يتم خلط الثقافة قبل إزالة قسامة للتجربة ، فلن يتم نقل عدد كافٍ من الخلايا البكتيرية إلى أنبوب الامتزاز. يجب أن يكون هناك عدد كافٍ من المستعمرات البكتيرية المتكونة في الأجار الناعم (أي العشب) للكشف عن اللويحات. استخدم خلاطًا دواميًا لإعادة تعليق بكتيريا المؤشر برفق إلى تعليق متجانس قبل نقل القسامات إلى أنابيب الامتزاز.

    امزج الخلايا البكتيرية والعاثية عن طريق تحريك الأنابيب برفق.

    احتضان خليط البكتيريا / البكتيريا لمدة 15-20 دقيقة (ليس أكثر من 30 دقيقة) عند درجة حرارة مناسبة لسلالة المؤشر.

    تحضير أجار لينة المغذيات وألواح أجار الصلبة: أثناء حدوث الامتزاز ، ضع أنبوبين ناعمين من أجار (سبق ذوبانهما وتخزينهما عند 55 & # x000b0C) في كتلة تسخين في مقعد المختبر الخاص بك على 46-48 & # x000b0C.

    يجب موازنة الأجار الناعم المذاب مع درجة حرارة كتلة التسخين لمدة 10-15 دقيقة. إذا استقر الأجار الناعم المذاب لمدة تزيد عن 15 دقيقة ، فسيبدأ في التصلب وسيشكل كتلًا عند سكبه على أجار صلب. إذا استقر الأجار الناعم المذاب أقل من 10 دقائق ، فسيكون ساخنًا جدًا عند إضافته إلى خليط البكتيريا / البكتيريا ، مما يؤدي إلى قتل الخلايا المضيفة قبل الطلاء. وبالتالي ، قد لا يتشكل العشب ويمكن اكتشاف عدد قليل من اللويحات أو لا يمكن اكتشافها على الإطلاق.

    قم بإعداد أنابيب أجار ناعمة إضافية في حالة تصفيح التخفيفات التسلسلية لمحلول الملتهمة.

    ضع علامة حول حافة الجزء السفلي (وليس الغطاء) لوحين من صفيحتين من المغذيات الصلبة مع اسمك على الأقل ، والتاريخ ، ونوع وسيط النمو ، و "Phage" أو "التحكم" المطابق لأنابيب الامتزاز.

    قم بتضمين لوحات إضافية مُصنَّفة بمعامل التخفيف في حالة الطلاء بالتخفيف المتسلسل.

    يجب أن تكون ألواح الأجار الصلبة جافة تمامًا دون تكاثف على الغطاء وأن يتم تسخينها مسبقًا لدرجة حرارة الغرفة قبل إضافة الأجار الناعم. إذا تم تخزين اللوحات في 4 & # x000b0C ، فقم بإزالتها عدة ساعات أو حتى في اليوم السابق. انشرها في أكوام صغيرة متداخلة لا تزيد عن 2-3 أطباق واتركها تجف. ستؤدي الرطوبة الزائدة في طبقة الآجار الصلبة إلى تخفيف الأجار الناعم ، مما يسمح للعاثية بالانتشار بسهولة أكبر من خلال الأجار الناعم أثناء تكوين البلاك. وبالتالي ، سيزداد حجم البلاك.

    أنابيب الامتزاز الصفائحية واحدة تلو الأخرى على النحو التالي: استخدم مرشح ميكرو P1000 لنقل خليط البكتيريا / البكتيريا بطريقة معقمة (يجب أن يكون حوالي 550 & # x003bcl) إلى أنبوب أجار ناعم ثم قم بتدويره بسرعة بين راحتي يديك لخلط المحتويات. لا تهز الأنبوب حتى يتم إدخال فقاعات الهواء. أمسك الأنبوب بيدك اليسرى ، وافتح غطاء لوحة أجار صلبة بيدك اليمنى و فورا صب محتويات الأنبوب بالكامل على سطح صفيحة أجار صلبة. قبل إغلاق الغطاء ، قم بتحريك اللوحة برفق ولكن بسرعة لنشر الأجار الناعم المذاب على كامل سطح اللوحة قبل أن يتاح لها الوقت لتصلب. تجنب رش الأجار الناعم المذاب على جوانب طبق بتري. إغلاق الغطاء.

    كرر الخطوة رقم 9 لجميع أنابيب الامتزاز ، أنبوب واحد في الوقت.

    ضع الألواح على سطح مستوٍ واسمح لهم بالوقوف دون إزعاج حتى يتجمد الأجار الناعم.

    عادة ما تكون 30 دقيقة كافية.

    اقلب الأطباق للحضانة.

    يمكن تكديس لوحات متعددة وتسجيلها معًا ثم قلبها للحضانة.

    بعد الحضانة ، يمكن فحص الصفائح بحثًا عن لويحات. يجب أن يحتوي عنصر التحكم السلبي على عشب من البكتيريا فقط (لا توجد ثقوب تشير إلى وجود لويحات). تختلف اللويحات من حيث الحجم والشكل والمظهر العام. يمكن عزل نوع معين من الملتهمة عن خليط غير متجانس من اللويحات عن طريق ثقب مركز إحدى اللويحات بعناية باستخدام عود أسنان معقم ونقل اللقاح إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 100 إلى 1000 & # x003bcl من المرق أو العازلة. يمكن طلاء هذا المحللة باستخدام نفس الإجراء الموصوف أعلاه. ما لا يقل عن 3 إلى 6 عزلات متتالية أحادية اللويحة ضرورية لضمان الحصول على ملتهمة نقية. في كثير من الأحيان يجب تخفيف المحللة على نطاق كبير (10-1 إلى 10-10) للعثور على عيار ينتج لويحات غير متداخلة على لوحة. يختلف العدد حسب حجم اللوحة.

    6. إجراء لوحة النسخ: نقل الخلايا لفحص المسوخ و auxotrophs

    تسمح هذه التقنية بمقارنة نمو الخلية على لوحة أولية باللوحات الثانوية ، مما يولد وسيلة لفحص الخلايا من أجل نمط ظاهري محدد. أولاً ، يتم تلقيح صفيحة أولية أو رئيسية بالخلايا إما عن طريق الطلاء المنتشر بالتخفيف الذي ينتج مستعمرات مفردة أو عن طريق نقلها إلى لوحة في نمط مكاني محدد بواسطة علامات الشبكة. يتم تلقيح الصفائح الثانوية التي تحتوي على وسائط مع مثبطات النمو أو الوسائط التي تفتقر إلى مغذيات معينة بخلايا من مستعمرات على الصفيحة الأولية. يتم إعادة إنتاج النمط المكاني للمستعمرات أولاً بضغط قطعة من المخمل على اللوحة الأولية. تلتصق الخلايا البكتيرية بالمخمل لأن تقاربها أكبر مع المخمل مقارنة بالأجار. يتم بعد ذلك نقل بصمة الخلايا الموجودة على المخمل إلى لوحات ثانوية متعددة مع نمو الخلية الذي يعكس نفس نمط المستعمرة مثل نمط اللوحة الأولية. بعبارة أخرى ، يشبه الأمر وجود ختم مطاطي ، ينسخ نمط النمو من صفيحة إلى أخرى. هذه التقنية مفيدة لأنها تسمح بفحص عدد كبير نسبيًا من المستعمرات في وقت واحد للعديد من الأنماط الظاهرية في تجربة واحدة.

    تحضير اللوحة الأولية: ضع علامة حول حافة الجزء السفلي (وليس الغطاء) من لوحة أجار مع اسمك على الأقل والتاريخ ونوع وسيط النمو.

    ضع علامة على شبكة في الجزء السفلي من اللوحة مع ما لا يقل عن خطين عموديين متباعدتين بشكل متساوٍ وخطين أفقيين على الأقل متباعدتين بشكل متساوٍ. ترقيم المربعات الناتجة.

    استخدم عود أسنان معقم مسبقًا لتلقيح كل مربع بعينة خلية. لكل عينة ، ارسم وسط المربع. لا تغطي المربع بأكمله بالخلايا (الشكل 8) وإلا ستتكاثر العينة عند احتضانها وتلوث المربعات المحيطة.

    سيتم تلقيح كل مربع بعينة مختلفة ، مشتقة إما من مزارع مرق أو مستعمرات على طبق آخر.

    اقلب واحتضان اللوحة الأولية ، والتي سيتم استخدامها لتلقيح الوسائط الثانوية المختلفة.

    تلقيح الصفائح الثانوية: كدس اللوحة الأساسية وجميع اللوحات الثانوية. باستخدام علامة ، ضع علامة اتجاه على جانب اللوحات. تأكد من أن العلامة على الجانب السفلي من كل لوحة ، وليس على الغطاء.

    أحضر قطعة قماش قطيفة معقمة وضعها على قطعة أسطوانية (الشكل 9). ثبت قطعة القماش القطيفة في مكانها باستخدام الحامل. لاحظ علامة الاتجاه على الكتلة.

    يجب أن تكون الكتلة بنفس حجم قاع طبق بتري (قطر 10.2 سم). يجب أن يأتي مع حلقة قفل تثبت القماش المخملي على الكتلة أثناء الطلاء المتماثل.

    يجب تعقيم قطعة القماش القطيفة (15.2 × 15.2 سم مربع) مسبقًا. قم بتجميع 10 أو 12 مربعًا نظيفًا ثم لفها بورق الألمنيوم ثم ضعها في الأوتوكلاف على درجة حرارة 121 & # x000b0C في الدورة الجافة (إعداد الجاذبية) لمدة 30 دقيقة. قبل استخدامها في تجربة طلاء طبق الأصل ، تأكد من جفافها تمامًا عن طريق وضعها في فرن دافئ لعدة ساعات. لاحظ أن المربعات القطيفة قد تحتاج إلى إزالة الوبر بشريط لاصق قبل التعقيم.

    يمكن إعادة استخدام المربعات المخملية. بعد تطهير المربعات القطيفة المستخدمة في الأوتوكلاف ، يجب شطفها بالماء العادي وإعادة تعقيمها كما هو موضح أعلاه.

    يجب تطهير الكتلة الأسطوانية والمشابك بين الاستخدامات بشطف قصير في 70٪ (حجم / حجم) إيثانول أو 10٪ كلور مبيض.

    قم بإزالة الغطاء وعكس اللوحة الأساسية. قم بمحاذاة علامة الاتجاه على اللوحة مع العلامة الموجودة على الكتلة. اخفض اللوح بحيث يكون سطح الأجار ملامسًا لقطعة قماش قطيفة على الكتلة الأسطوانية. اضغط برفق ولكن بالتساوي مع أطراف أصابعك على الجزء الخلفي من اللوحة الأساسية ثم ارفع اللوحة الأساسية بعيدًا عن الكتلة. استبدل الغطاء الموجود على اللوحة.

    يمكن استخدام الانطباع المخملي للخلايا من اللوحة الأولية لتلقيح ما يقرب من 7-8 لوحات ثانوية قبل أن يتم عمل انطباع بمخمل جديد.

    كرر الخطوة رقم 7 مع كل من اللوحات الثانوية.

    كعنصر تحكم إيجابي ، يجب أن تكون اللوحة الأخيرة في السلسلة وسيط أجار حيث يجب أن تنمو جميع السلالات المختبرة. بهذه الطريقة يمكنك التأكد من نقل الخلايا إلى جميع اللوحات الثانوية في السلسلة. خلاف ذلك ، قد يُعزى نقص النمو على وسط اختبار معين إلى عدم كفاية نقل الخلايا بدلاً من النمط الظاهري للسلالة.

    لتجنب الإيجابيات الخاطئة ، يجب طلب الألواح الثانوية من الركيزة الأقل إلى الأكثر ملاءمة. خلاف ذلك ، يمكن نقل العناصر الغذائية بين الصفائح مما يسمح للخلايا بالنمو على وسط غير موات.

    اقلب الأطباق واحتضانها.

    ملاحظة: عند فحص اللوحات الثانوية للنمو ، تأكد من التمييز بين النمو والبصمة. هذا الأخير نتيجة سلبية.

    7. تنظيف مساحة العمل

    قم بإيقاف تشغيل موقد بنسن ثم ضع كل المستلزمات بعيدًا بما في ذلك المزارع على الألواح أو الأنابيب والوسائط الإضافية والكواشف الأخرى.

    لا تسمح للمزارع القديمة ، سواء على الأطباق أو في الأنابيب ، بالتراكم على منضدة المختبر أو في مناطق التخزين. يجب التخلص من هذه العينات ، التي تعتبر مصادر سيئة السمعة للتلوث مثل العفن والأنواع البكتيرية غير المرغوب فيها ، بمجرد عدم الحاجة إليها.

    ضع أدوات المختبر الملوثة (القفازات ، وأطراف الماصة ، ومناديل الكيموي) ، والأواني الزجاجية (الأنابيب ، والقوارير ، والزجاجات) ، والنفايات الخطرة (المزارع البكتيرية أو محاليل العاثيات ، والألواح المستخدمة) في وعاء التخلص المناسب. عند العمل مع غير مسببة للأمراض بكتريا قولونية سلالة (BSL-1) ، يتم إنتاج النفايات الخطرة غير المعدية فقط. عند تنفيذ نفس الإجراءات مع الكائنات المسببة للأمراض (BSL-2 أو أعلى) ، تتولد النفايات الخطرة المعدية. بغض النظر عن تصنيف الخطر البيولوجي ، يجب تعقيم النفايات الخطرة أو تطهيرها قبل التخلص منها. اتبع الإرشادات الموضحة في BMBL (الإصدار الخامس) بالإضافة إلى تلك المقدمة من قسم الصحة والسلامة البيئية في مؤسستك للتخلص الفوري والسليم من المخاطر البيولوجية التي تم إنشاؤها أثناء التجربة.

    نظف منطقة العمل بالمطهر.

    اغسل يديك جيدًا بالصابون المطهر والماء الدافئ قبل مغادرة المختبر.

    8. ممثل النتائج

    تقنية لوحة الخط. يظهر تطبيق نموذج لطلاء الخط في شكل 1. يستخدم هذا الإجراء لعزل المستعمرات البكتيرية من مزارع الخلايا المختلطة وهو إلى حد بعيد أحد أهم التقنيات لإتقان علم الأحياء الدقيقة وعلم الوراثة الجزيئي. تمثل كل مستعمرة مجموعة من الخلايا المتطابقة وراثيا. بالنسبة للعديد من تطبيقات المصب ، من الضروري البدء إما بمستعمرة واحدة أو ثقافة بكتيرية نقية ناتجة عن تلقيح الوسائط بخلايا من مستعمرة واحدة. على سبيل المثال ، يمكن فحص مورفولوجيا الخلايا الفردية داخل مستعمرة باستخدام مجهر ضوئي. يمكن تعيين الهوية الجينية عن طريق تسلسل جين الحمض النووي الريبي الريبوزومي الصغير للوحدة الفرعية من الحمض النووي الجيني المعزول من ثقافة الخلية التي بدأت بمستعمرة واحدة. ويمكن وصف الخصائص الأيضية بإخضاع الخلايا لفحوصات كيميائية حيوية وفسيولوجية مختلفة. فقط من خلال إجراء مثل هذه التجارب على الثقافات النقية يمكن للمرء أن يكون متأكدًا من الخصائص المنسوبة إلى كائن حي دقيق معين. النتائج لا تحجبها احتمالية أن تكون الثقافة ملوثة. قد تحدث أخطاء فنية إذا لم يتم الحفاظ على عقم الأداة المستخدمة لخط الخلايا عبر اللوحة طوال الإجراء. نسيان حرق حلقة أو استعادة عود أسنان جديد بين الأرباع يجعل من الصعب الحصول على مستعمرات مفردة. لا يمكن عزل بعض الأنواع البكتيرية في الثقافة النقية لأنها تعتمد على ارتباط تعاوني مع أنواع بكتيرية أخرى لمتطلبات نمو معينة. يشار إليها باسم syntrophs ، يمكن أن تنمو هذه الكائنات فقط في ظل ظروف الاستزراع المشترك ، لذلك فإن المستعمرات (إذا تشكلت) ستتألف دائمًا من نوعين أو أكثر. هناك تحدٍ آخر واجهناه في المختبر عند تنفيذ إجراء لوحة الخط مع البكتيريا المستمدة من العينات البيئية وهو أن الخلايا تظهر خصائص نمو تنحرف عن سلالات المختبر التقليدية مثل بكتريا قولونية. قد تنتج مثل هذه السلالات البكتيرية مستعمرات خيطية (على عكس مجموعات الخلايا الضيقة) بفروع تنتشر على جزء كبير من صفيحة أجار ، متكلسة وبالتالي مقاومة للاختراق بواسطة أداة صفيحة خطية ، أو محاطة بكبسولة لزجة بحيث لا يمكن تمييز المستعمرات الفردية. هذه الخصائص تجعل من الصعب تنقية المستعمرات المفردة بتقنية لوحة الخط.

    تقنية صب لوحة. باستخدام تقنية لوحة الصب ، تتشكل المستعمرات داخل أجار وكذلك على سطح وسط أجار مما يوفر وسيلة ملائمة لحساب عدد الخلايا القابلة للحياة في العينة. يستخدم هذا الإجراء في مجموعة متنوعة من التطبيقات الصناعية. على سبيل المثال ، من الأهمية بمكان لمحطة معالجة مياه الصرف الصحي ، المسؤولة عن تنظيف النفايات السائلة (على سبيل المثال ، مياه الصرف الصحي ، الجريان السطحي من مصارف العواصف) الناتجة عن الخصائص المنزلية والتجارية والصناعية وكذلك الممارسات الزراعية ، لتحليل المياه عينات بعد عملية تنقية واسعة النطاق. يتم إعادة استخدام مياه الصرف الصحي المعالجة (المياه غير الصالحة للشرب) بعدة طرق - لري المحاصيل غير الغذائية في الزراعة ، وللتطهير الصحي في المساكن ، وفي أبراج التبريد الصناعية - لذلك يجب أن تكون خالية من التلوث الكيميائي والميكروبي. يجب تنقية مياه الشرب (مياه الشرب) وفقًا لمعايير وكالة حماية البيئة واختبارها باستخدام طرق الطلاء الميكروبيولوجية التي تسمح بتعداد مسببات الأمراض البشرية المحددة. تظهر في الشكل 10 هي مستعمرات بكتيرية ناتجة عن خلايا بكتيرية موجودة في عينة مياه تم جمعها من نافورة مياه عامة. من غير المحتمل أن تكون مسببات الأمراض البكتيرية هي التي أنتجت هذه المستعمرات نظرًا لتدابير تنقية مياه الشرب ، ومع ذلك ، فإن الميكروبات موجودة في كل مكان ويمكن التقليل من التلوث حتى عن طريق السلالات غير المسببة للأمراض فقط ، وليس القضاء عليها تمامًا. كمثال آخر ، تحتاج شركة الأدوية إلى تقييم درجة التلوث الجرثومي ، أو العبء الحيوي ، لدواء جديد أثناء الإنتاج والتخزين والنقل. عن طريق أخذ عينات من الدواء خلال مراحل مختلفة من العملية وطلاء العينات باستخدام إجراء لوحة الصب ، يمكن بسهولة تحديد الحمل الميكروبي ، أو عدد البكتيريا الملوثة. يمكن بعد ذلك وضع تدابير احترازية لتقليل التلوث الجرثومي أو القضاء عليه. أحد الأخطاء الفنية الأكثر شيوعًا التي تحدث عند تنفيذ تقنية صب اللوح هو الخلط غير الكافي للعينة مع الأجار الذائب مما يتسبب في تكتل المستعمرات معًا مما يجعل عدد الصفائح غير دقيق. خطأ شائع آخر هو سكب الأجار المذاب عندما يكون شديد السخونة ، مما يؤدي إلى قتل العديد من الخلايا البكتيرية في العينة. سيؤثر هذا الخطأ أيضًا على دقة عدد الصفائح التي تعطي أرقامًا أقل من العدد الإجمالي لوحدات تشكيل المستعمرة في العينة.

    تقنية لوحة الانتشار. تشبه تقنية لوحة الانتشار إجراء لوحة الصب من حيث فائدتها كوسيلة لأداء عدد لوحات قابلة للتطبيق. ومع ذلك ، نظرًا لأن المستعمرات التي تتشكل باستخدام تقنية لوحة الانتشار موزعة بالتساوي عبر سطح وسط أجار ، يمكن عزل الخلايا من المستعمرات الفردية واستخدامها في التلاعب التجريبي اللاحق (على سبيل المثال ، كقاح للوحة الخط أو ثقافة المرق). هناك ثلاثة تطبيقات شائعة تعتبر فيها تقنية لوحة الانتشار مكونًا مهمًا وهي تجارب الإثراء والاختيار والغربلة. في جميع التطبيقات الثلاثة ، يمكن فصل نوع الخلية المطلوب من الخليط وإخضاعها لاحقًا لأي عدد من الاختبارات البيوكيميائية أو الفسيولوجية أو الجينية.

    ان تجربة التخصيب ينطوي على طلاء ثقافة مختلطة على وسط أو حاضنة في ظروف بيئية تساعد على نمو تلك الكائنات الدقيقة داخل العينة التي تظهر الخصائص الأيضية المطلوبة ، أو خصائص النمو ، أو السلوكيات. لا تمنع هذه الإستراتيجية نمو الكائنات الحية الأخرى ولكنها تؤدي إلى زيادة عدد الكائنات الحية الدقيقة المرغوبة مقارنة بالآخرين في الثقافة. وبالتالي ، من المحتمل أن تعرض المستعمرات التي تتشكل على لوحة التخصيب خصائص نمطية تعكس النمط الجيني المطلوب. على سبيل المثال ، إذا كان هدفك هو زراعة بكتيريا مثبتة للنيتروجين من عينة بيئية تحتوي على خليط من أكثر من 1000 نوع بكتيري مختلف ، فإن طلاء العينة على وسط يعاني من نقص النيتروجين سيثري تلك البكتيريا التي يمكنها إنتاج هذا المركب من الغلاف الجوي باستخدام القدرات الأيضية التي توفرها مجموعة من الجينات اللازمة لتثبيت النيتروجين.

    أ تجربة الاختيار ينطوي على تصفيح مزرعة مختلطة على وسط يسمح فقط لتلك الخلايا التي تحتوي على جين معين أو مجموعة من الجينات بالنمو. هذا النوع من التجارب شائع في مختبرات البيولوجيا الجزيئية عند تحويل السلالات البكتيرية بالبلازميدات التي تحتوي على جينات مقاومة للمضادات الحيوية. إذا كان هدفك هو زراعة الخلايا المؤتلفة فقط ، أو تلك التي استوعبت البلازميد بنجاح ، فإن طلاء العينة على وسيط تم استكماله بتركيز مناسب من المضاد الحيوي سيختار لتلك الخلايا التي تظهر مقاومة لهذا الدواء المعين.

    أ تجربة الفرز يتضمن طلاء مزرعة مختلطة على وسط يسمح لجميع الخلايا القابلة للحياة بالنمو ، ومع ذلك ، يمكن تمييز الخلايا ذات النمط الجيني المطلوب عن الخلايا الأخرى بناءً على النمط الظاهري. مرة أخرى ، هذا النوع من التجارب شائع في مختبرات البيولوجيا الجزيئية عند إجراء فحوصات الطفرات أو استنساخ الجينات إلى بلازميدات.مثال كلاسيكي ، كما هو موضح في الشكل 11، يستفيد من لاكز ترميز الجينات & # x003b2-galactosidase ، يسمح هذا الإنزيم للخلايا باستقلاب X-Gal (5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل - & # x003b2-D-galactopyranoside) ، وهو تناظرية ركيزة من ركائزها الطبيعية ، اللاكتوز. ينتج عن انشقاق X-Gal بواسطة & # x003b2-galactosidase منتج أزرق غير قابل للذوبان. وبالتالي ، إذا كان الوسيط يحتوي على X-gal ، وعينة تحتوي على خلايا من النوع البري (وظيفي) أو متحولة (غير وظيفية) لاكز يتم طلاء الجين على هذا الوسط ، ثم بعد حضانة الخلايا البرية من النوع التي تؤوي وظيفية لاكز سيظهر الجين على شكل مستعمرات ذات صبغة زرقاء بينما الخلايا الطافرة مع غير وظيفية لاكز سيظهر الجين كمستعمرات غير مصبوغة ("بيضاء").

    تتم مواجهة مشكلة فنية بشكل متكرر عند تعلم كيفية تنفيذ تقنية لوحة الانتشار لأول مرة وهي الانتشار غير المتكافئ للخلايا عبر سطح أجار. عند استخدام القرص الدوار والقضيب الزجاجي ، قد يتم امتصاص العينة بسرعة كبيرة بحيث لا تتشكل المستعمرات إلا بالقرب من مركز اللوحة. عند القيام بـ "طريقة كوباكابانا" ، يتم تحريك الخرز الزجاجي بدلاً من اهتزازه عبر سطح الآجار. وبالتالي ، تنمو العديد من المستعمرات على طول الحافة الخارجية للصفيحة. في كلتا الحالتين ، لا يستفيد التوزيع الناتج للمستعمرات من مساحة السطح الكاملة المتاحة لذلك قد تتجمع الخلايا معًا وتنمو إلى مستعمرات متداخلة مما يجعل تعداد الصفائح غير دقيق أو تمييز أنواع الخلايا غير ممكن.

    تقنية تراكب أجار لينة. يمكن استخدام إجراء مشابه لتقنية لوحة الانتشار المستخدمة لعد المستعمرات البكتيرية لحساب عدد العاثيات. في حين أن ما بين 30 و 300 خلية بكتيرية منتشرة على سطح أجار لعدد الصفائح (cfu / ml) ، يتم خلط ما بين 100 و 400 جسيم ملتهي مع 10 8 إلى 10 9 خلايا مضيفة لتعداد البلاك (pfu / ml) داخل طبقة من الآجار الناعم المنتشر عبر سطح أجار المغذيات الصلبة. ما لم يتم إثبات خلاف ذلك ، يُفترض عمومًا أن خلية بكتيرية واحدة تنقسم وتتراكم أعدادًا كبيرة من الخلايا المتماثلة وراثيًا في مجموعة واحدة تسمى مستعمرة. كما نوقش سابقًا ، هذا الافتراض غير صالح عندما تنمو الخلايا في عناقيد (أي ، أزواج ، رباعيات ، سلاسل ، أو مجموعات) أو تعرض خصائص النمو مثل الكبسولات التي تعيق تكوين مستعمرة واحدة. يتم إجراء افتراض مماثل لتشكيل اللويحة ، حيث تمثل كل لوحة نشاطًا لعاثية واحدة. هذه العبارة صحيحة فقط إذا أصابت عاثية واحدة بكتيريا واحدة. ماذا يحدث إذا أصابت عدة جسيمات فجائية بكتيريا واحدة؟ تتعلق هذه المشكلة بمعامل إحصائي مهم يجب مراعاته عند إجراء تجارب على الملتهمة - تعدد العدوى (MOI) - تصف نسبة جسيمات الملتهمة المعدية إلى عدد الخلايا المضيفة في العينة. نظرًا لأن بعض الخلايا تمتص أكثر من فجوة واحدة بينما تمتص الخلايا الأخرى فجوة واحدة فقط أو لا تمتص ، يجب إصابة مجموعة من الخلايا المضيفة بوزارة الداخلية المنخفضة (& # x022641) لتقليل احتمالية إصابة الخلية بأكثر من فجوة واحدة الجسيم. يؤدي استخدام وحدة تشكيل البلاك (pfu) كتعريف وظيفي إلى تجنب هذه المضاعفات عند إجراء عدد البلاك لحساب عيار مخزون الملتهمة.

    كما هو موضح في الشكل 12، يختلف مورفولوجيا البلاك باختلاف فج. تولد بعض الملتهمات لويحات صغيرة (اللوحة أ) بينما ينتج البعض الآخر لويحات كبيرة (اللوحة ب). يؤثر عدد من المتغيرات على حجم البلاك. هناك أسباب فنية تساهم في هذا التباين. على سبيل المثال ، تدعم الوسائط الكاملة والأجار الصلب السميك تطوير لويحات أكبر لأن الخلايا المضيفة يمكنها الحفاظ على نمو العاثية لفترة أطول من الوقت. ستؤدي كثافة الطلاء العالية للخلايا المضيفة (& # x0003e10 9 cfu لكل لوحة) إلى تقليل حجم اللويحة. سيؤدي استخدام تركيزات منخفضة من الآجار الناعم إلى زيادة معدل انتشار جسيم الملتهمة في الأجار الناعم وبالتالي زيادة حجم اللويحات. تذكر أن معدل الانتشار المتزايد هذا يمكن أن يحدث عن غير قصد إذا لم تكن ألواح الأجار الصلبة جافة تمامًا بحيث يؤدي التكثيف أو الرطوبة الزائدة في الطبق إلى تخفيف الأجار الناعم في التراكب. سيؤدي هذا الإشراف الفني إلى نتائج غير متسقة فيما يتعلق بحجم اللوحة لعاثة معينة.

    يرتبط حجم اللويحة أيضًا بعدد من أحداث الخلية المضيفة بما في ذلك كفاءة الامتصاص ، ومدة الفترة الكامنة (الفترة الزمنية من امتزاز الملتهمة إلى تحلل الخلية المضيفة) ، وحجم الاندفاع (عدد السلالة الصادرة بواسطة عدوى واحدة). يمكن ملاحظة خليط غير متجانس من أحجام اللويحات إذا أصابت جزيئات الملتهمة الخلايا المضيفة في مراحل مختلفة من نمو البكتيريا. على سبيل المثال ، أولئك الذين يمتصون خلال المرحلة الأسية المبكرة يصنعون لويحات أكبر ذات ذرية أكبر من تلك التي تمتص في المرحلة الأسية المتأخرة. كقاعدة عامة ، تنتج العاثية اللايتية لويحات واضحة بينما تشكل العاثية اللايسوجينية لويحات عكرة. ومع ذلك ، فإن بعض العاثيات اللايتية تنتج أنماطًا مثيرة للاهتمام مثل لوحة "عين الثور" الموضحة في الشكل 12 ب. هذه اللويحات الشفافة محاطة بهالة عكر لأن تلك الخلايا الموجودة على حافة اللويحة ليست متحللة بالكامل أو قد تكون مقاومة لعدوى الملتهمة. نمط "عين الثور" الذي لوحظ مع الملتهمة المعتدلة عبارة عن لوحة ذات مركز عكر محاط بحلقة شفافة. يعكس هذا التشكل وزارة الداخلية وعلم وظائف الأعضاء للخلية المضيفة فيما يتعلق بقرار تحلل الجينات. عندما تصاب الخلايا بالعاثية لأول مرة ، تكون وزارة الداخلية منخفضة وتنمو الخلايا بسرعة لأن المغذيات وفيرة معًا مما يسهل نمو الخلايا. كلما تم تحلل المزيد والمزيد من الخلايا ، تزداد وزارة الداخلية وتتشكل لوحة صافية. ومع ذلك ، تستمر Lysogens في وسط اللويحة في النمو لأنها محصنة ضد التحلل مما يؤدي إلى ظهور لوحة صافية ذات مركز عكر.

    يمكن تعديل تقنية التراكب لمقايسات البلاك مع فيروسات حقيقية النواة. بنفس الطريقة التي تشكل بها البكتيريا العاثية لويحات على العشب من الخلايا البكتيرية في الآجار الناعم ، تشكل الفيروسات حقيقية النواة لويحات على طبقة أحادية من الخلايا مغطاة بالهلام. الطبقة الأحادية هي طبقة متكدسة من الخلايا تنمو جنبًا إلى جنب على سطح طبق مستنبت ، تلامس بعضها البعض ولكنها لا تنمو فوق بعضها البعض. لتنفيذ هذا النوع من فحص البلاك ، تتم إضافة قسامات من الفيروس إلى طبقات أحادية حساسة من الخلايا حقيقية النواة. ثم يتم تغطية الطبقة الأحادية بوسط غذائي قائم على الاغاروز - هذا الهلام يحد من انتشار فيروسات النسل المنبعثة من الخلايا المصابة إلى الخلايا المجاورة في الطبقة الأحادية. وفقًا لذلك ، يتم إنتاج منطقة كروية ، أو لوحة ، تحتوي على خلايا تالفة بسبب إطلاق الفيروسات. للمساعدة في تصور اللويحات ، يمكن تطبيق الأصباغ التي تلطخ الخلايا الحية على ثقافة الخلية مما يوفر التباين بين الخلايا المصابة وغير المصابة.

    تُستخدم تقنية تراكب الأجار الناعم في تجارب أخرى غير فحوصات البلاك. أولاً ، من المهم أن نتذكر أن أجار المغذيات الصلبة عبارة عن مصفوفة داعمة تسمح بنمو البكتيريا. ثانيًا ، يمكن أن يحتوي الأجار الناعم المستخدم في التراكب على تركيبة مغذية مختلفة عن الأجار الصلب. بهذه الطريقة ، يمكن أن يعمل الأجار الناعم كوسيلة لفحص السلالات البكتيرية لمختلف خصائص النمو أو الخصائص الأيضية. على سبيل المثال ، يتم استخدام تقنية التراكب لفحص البكتيريا للقدرة على تحلل السليلوز (Teather and Wood 1982). تزرع المستعمرات المفردة على وسط أجار صلب غير انتقائي ثم ينتشر أجار ناعم يحتوي على 0.1٪ (وزن / حجم) كربوكسي ميثيل السليلوز (CMC) على سطح الآجار الصلب. بعد الحضانة ، يتم غمر اللوحات بالبقع التي تسمح بتصور مناطق التطهير حول المستعمرات في الأجار الناعم. يحدث التصفية بسبب الإنزيمات المتحللة بالماء التي تفرزها البكتيريا التي تكسر السليلوز في الوسط. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام تقنية التراكب لاكتشاف البكتيريا التي تمنع نمو العتائق الميثانوجينية الموجودة في كرش الماشية (جيلبرت وآخرون. 2010). تزرع العزلات البكتيرية المأخوذة من العينات البيئية على وسط مغذي أجار صلب ثم تغطى المستعمرات بأجار رقيق يحتوي على ثقافة الميثانوجينات. بعد الحضانة ، يتم فحص الصفائح بحثًا عن مناطق تثبيط النمو حول المستعمرات. تحدد هذه الطريقة السلالات البكتيرية التي تنتج مثبطات الميثانوجينات في الأجار الناعم.

    أكثر الأخطاء الفنية شيوعًا التي تحدث مع تقنية تراكب الأجار الناعم هي سكب الأجار الناعم المذاب إما عندما يكون ساخنًا جدًا أو باردًا جدًا. إذا كان الجو حارًا جدًا ، فسيتم قتل الخلايا البكتيرية المختلطة في الوسط قبل الطلاء. إذا كان الجو باردًا جدًا ، فسيشكل الأجار الناعم كتلًا عند سكبه على أجار صلب. في كلتا الحالتين ، ستكون النتائج غامضة أو غير قابلة للقراءة في أحسن الأحوال.

    إجراء لوحة النسخ المتماثلة. يصبح نقل الثقافات من نوع واحد من وسط المغذيات إلى آخر لاختبار متطلبات النمو أمرًا شاقًا للغاية إذا كان هناك أكثر من مجرد سلالات قليلة. الطلاء المتماثل هو طريقة تسمح بالفحص المتزامن لعدد كبير من الكائنات الحية الدقيقة. على سبيل المثال ، بعد إحداث طفرة في مزرعة من الخلايا البرية ، يمكن للمرء أن ينشر تخفيفات الصفيحة للثقافة للحصول على صفائح ذات مستعمرات مفردة. تحتوي الصفائح الأولية على وسيط يدعم نمو جميع الخلايا بما في ذلك الكائنات الأولية من النوع البري ، والتي تقوم بتجميع جميع المركبات المطلوبة للنمو ، و auxotrophs المتحولة ، والتي تحمل طفرة جينية في مسار التخليق الحيوي مما يجعلها غير قادرة على تصنيع مركبات معينة ضرورية للنمو. عن طريق طلاء خليط الخلايا على وسط كامل ، يمكن امتصاص العناصر الغذائية المفقودة من البيئة. للتمييز بين الكائنات الأولية و auxotrophs ، يمكن تكرار المستعمرات على وسط ضئيل. فقط الكائنات الأولية ستكون قادرة على النمو. نظرًا للحفاظ على النمط المكاني للوحة الأولية ، فإن مقارنة اللوحة الثانوية باللوحة الأولية تسمح بتحديد المستعمرات الطافرة. لتحديد المركب الذي لم تعد الطفرات قادرة على تصنيعه ، يمكن تكرار المستعمرات على وسائط قليلة مكملة بمركبات معينة (على سبيل المثال ، الأحماض الأمينية ، ومصادر الكربون ، والفيتامينات ، وما إلى ذلك). بهذه الطريقة ، يمكن فحص مئات المستعمرات في نفس الوقت باستخدام إجراء لوحة النسخ. أحد الأخطاء التقنية التي يمكن أن تحدث هو استخدام ألواح أجار شديدة الرطوبة ، مما يتسبب في تشويه المستعمرات معًا مما يؤدي إلى تلويث جميع الثقافات الموجودة على اللوحة. ينتج عن هذا نتائج غير موثوقة تمامًا. خطأ تقني آخر هو تطبيق الكثير من الضغط عند نقل الخلايا من القطيفة إلى الصفائح الثانوية. مرة أخرى ، بعد احتضان الصفائح الثانوية ، قد تتداخل المستعمرات الناتجة لإنتاج أنماط ظاهرية للنمو تُعزى إلى التلوث بدلاً من الضمور العضلي.

    ليست كل الأنواع الميكروبية من النوع البري عبارة عن بدائل ، لذلك يمكن استخدام إجراء لوحة النسخ المتماثلة لفحص سلالات مختلفة من النوع البري في وقت واحد لمتطلبات النمو المميزة. كما هو موضح في الشكل 13، "dabs" من الخلايا من أربعة مختلفة الزائفة تم طلاء السلالات البكتيرية في نسختين على لوحة ذات علامات شبكية تحتوي على وسائط كاملة تسمى YTA (اللوحة A). تم تكرار السلالات بعد ذلك على ثلاث لوحات ثانوية (الألواح B و C و D) تتكون من متوسط ​​ضئيل (MSA) مكمل بمصدر كربون مختلف (أسيتاميد ، ولاكتوز ، وجلايسين ، على التوالي). تظهر النتائج أن اثنين من الأربعة الزائفة سلالات (P. الزنجارية و P. stutzeri) غير قادرة على النمو على مصادر الكربون الثلاثة هذه. كعنصر تحكم ، تم تكرار السلالات على لوحة رابعة باستخدام وسط YTA لتأكيد نقل الخلايا طوال الإجراء. نظرًا لأن جميع السلالات الأربعة تنمو على لوحة التحكم YTA ، فإن أوجه القصور في النمو المعروضة على اللوحات الثلاثة السابقة في السلسلة موثوقة. يتم جدولة نتائج الطلاء المتماثل بتنسيق الجدول 1. أحد الأخطاء الشائعة هو تفسير بصمة النمو على لوحة ثانوية كنتيجة إيجابية. على سبيل المثال ، قارن النمط الظاهري لـ P. الزنجارية لذلك من P. stutzeri على MSA + أسيتاميد (اللوحة B). يعرض الأخير بصمة النمو ، وهي نتيجة سلبية ، ويمكن أن تحدث إذا تم نقل العناصر الغذائية من اللوحة السابقة مع الخلايا الأم. لا يحدث نمو جديد للخلايا لأن العناصر الغذائية المفقودة غير متوفرة لخلايا النسل. من السهل الخلط بين بصمة والنمو الفعلي. إذا كنت في شك ، يجب تكرار التجربة باستخدام طريقة بديلة مثل خلايا الطلاء من اللوحة الأولية على الوسائط الثانوية.

    شكل 1. مثال على مستعمرات مفردة على طبق. الكرات الوردية بالقرب من مركز الصفيحة هي مستعمرات السراتية الذابلة، وهي بكتيريا سالبة الجرام على شكل قضيب في عائلة Enterobacteriaceae. نظرًا لتفضيلها للبيئات الرطبة ، توجد هذه الكائنات الحية الدقيقة بشكل شائع تنمو في زوايا أحواض الاستحمام ، وأحواض المغسلة ، وجص البلاط ، وعلى ستائر الحمام. S. marcescens من السهل التعرف عليه لأنه ينتج صبغة حمراء تسمى بروديجيوسين. تم إنشاء المستعمرات الموجودة على هذه اللوحة باستخدام تقنية لوحة الخطوط ، مع ظهور مستعمرات مفردة في الربع الرابع بعد الحضانة عند 30 & # x000b0C لمدة 24 ساعة. تُظهر الأرباع الثلاثة الأخرى نموًا متكدسًا تطورت فيه الخلايا المودعة على سطح الآجار إلى مستعمرات متداخلة.

    الشكل 2. الأدوات المستخدمة لتقنية لوحة الخط. من أعلى إلى أسفل ، تظهر عيدان الأسنان (مفلطحة وليست دائرية) ، وحلقة سلكية ، وحلقة بلاستيكية يمكن التخلص منها ، وعصي خشبية. عادة ما يتم نقل المسواك إلى دورق زجاجي صغير مع نهاية عريضة لأسفل ثم يتم تغطيتها برقائق معدنية عند تعقيمها للتعقيم قبل الاستخدام. يتم نقل أعواد خشبية إلى أنابيب اختبار مقاس 18 مم ثم تعقيمها قبل الاستخدام.

    الشكل 3. (أ) تقنية Streak-plate باستخدام الطريقة الرباعية. يتم استخدام حلقة معقمة مسبقًا أو عصا أو عود أسنان لتوزيع العينة عبر ربع سطح أجار بحركة سريعة وسلسة وخلفية ورابعة من الحافة إلى مركز اللوحة. يتكرر هذا الإجراء لكل من الأرباع الأربعة للوحة. بعد الحضانة ، يظهر نمو الخلايا على طول مسار الأداة المستخدمة لإيداع الخلايا على اللوحة. يجب أن ينتج عن الفصل الميكانيكي للخلايا في عينة مختلطة باستخدام هذه التقنية مستعمرات مفردة في الربع الرابع (انظر شكل 1 على سبيل المثال). يشار إلى المستعمرات المفردة على أنها وحدات تشكيل مستعمرات (cfu). (ب) عند استخدام حلقة معدنية لطلاء الخطوط ، يجب تعقيمها باستخدام لهب موقد بنسن قبل ملامسة اللقاح أو وسط أجار. تذكر أن الجزء الأكثر سخونة من اللهب هو طرف المخروط الأزرق. أمسك بمقبض الجهاز ، ضع السلك في اللهب على بعد حوالي 3-4 بوصات من الحلقة. اتركه طويلاً بما يكفي حتى يصبح السلك أحمر حارًا. حرك السلك بحيث يقترب اللهب من الحلقة. تأكد من تبريد الحلقة المعدنية قبل لمس اللقاح.

    الشكل 4. تقنية صب الصفيحة. (أ) يتم توزيع حجم صغير من العينة (بين 0.1 إلى 1.0 مل) بشكل معقم ومعقم في طبق بتري فارغ ولكنه معقم باستخدام ماصة مصلية 5.0 مل. (ب) أجار ذائب متوازن إلى درجة حرارة تقارب 48 & # x000b0C ثم يُسكب في طبق بتري مع العينة. بعد إغلاق الغطاء ، يتم تحريك اللوحة برفق لخلط العينة والأجار المذاب. يُسمح للأجار بالتصلب لمدة 30 دقيقة تقريبًا ثم يتم قلب الصفائح للحضانة.

    الشكل 5. تقنية لوحة الانتشار مع قرص دوار وموزع زجاجي. بعد وضع لوحة أجار على قرص دوار ، يتم توزيع حجم صغير من العينة (0.1 إلى 0.2 مل) بطريقة معقمة على وسط اللوحة باستخدام مرشح ميكرو. يتم تعقيم الموزع عن طريق غمسه في كوب من الإيثانول ثم تمريره عبر شعلة موقد بنسن لإشعال الإيثانول الزائد. قبل ملامسة العينة ، يجب تبريد الموزعة عن طريق ملامستها للأجار بالقرب من حافة اللوحة. يتم تحريك الموزعة برفق ذهابًا وإيابًا من خلال العينة عبر اللوحة أثناء دوران القرص الدوار ببطء. يسمح هذا الإجراء بالانتشار التدريجي ولكن المتساوي للعينة عبر سطح أجار. بعد إغلاق الغطاء ، يجب ضبط اللوحة على سطح المنضدة دون إزعاج لمدة 5 دقائق على الأقل للسماح للعينة بالامتصاص بالكامل في الأجار قبل قلب اللوحة للحضانة.

    الشكل 6. تقنية ألواح الانتشار مع الخرز الزجاجي (طريقة كوباكابانا). تصب حبات الزجاج التي تم تعقيمها مسبقًا في الأوتوكلاف على سطح صفيحة أجار موضوعة على سطح المنضدة. يتم توزيع حجم صغير من العينة (100 إلى 150 & # x003bcl) في جو معقم ومعقم على مركز الأجار باستخدام مرشح ميكرو. مع إغلاق غطاء اللوحة ، يتم استخدام حركة اهتزاز أفقية لتحريك الخرزات بلطف ذهابًا وإيابًا عبر اللوحة من 6 إلى 7 مرات ، مما يؤدي إلى نشر العينة. يتكرر هذا الإجراء بعد تدوير اللوحة 60 & # x000b0. تتكرر حركة الاهتزاز للمرة الثالثة بعد دوران آخر 60 & # x000b0. بمجرد امتصاص العينة بالكامل في وسط أجار ، تُسكب الحبيبات في دورق يحتوي على 10٪ مبيض. ثم يتم قلب الصفائح للحضانة.

    الشكل 7. تقنية تراكب الأجار الناعم المستخدمة لعزل وتعداد الملتهمة بناءً على تكوين اللويحات (وتسمى أيضًا مقايسة اللويحة). (أ) يمكن الكشف عن وجود الملتهمة كمناطق تطهير ، أو لويحات ، على تعليق متكدس للمستعمرات البكتيرية التي تنمو في أجار ناعم. Phage T4 هي فجوة DNA خبيثة مزدوجة الشريطة تصيب مضيفها ، الإشريكية القولونية، مما يتسبب في تحلل الخلايا المضيفة وإطلاق العاثية. بعد جولات متعددة من العدوى والتحلل المجاور بكتريا قولونية تختفي الخلايا الموجودة في المنطقة المحيطة بالخلية المضيفة الأصلية المصابة تاركة لوحة تحتوي على بلايين من جزيئات T4 الملتهمة. تنتج Phage T4 لويحات يبلغ قطرها حوالي 1 مم. في هذه التجربة ، تم خلط 200 & # x003bcl من 10 -5 تخفيف من 2 × 10 8 pfu / ml من Phage T4 مع ما يقرب من 300 & # x003bcl من بكتريا قولونية تم تحضير خلايا المؤشر كثقافة مهواة متنامية باطراد عند 37 & # x000b0C. تمت إضافة كل من الملتهمة والبكتيريا إلى أنبوب أجار ناعم EHA ، وخلطهما ، ثم صبهما على سطح صفيحة أجار صلبة من EHA. لاحظ أنه لم يكن من الضروري السماح للعاثية والبكتيريا بالامتزاز قبل الطلاء في هذه الحالة. بعد السماح للأجار الناعم بالتصلب دون إزعاج لمدة 20 دقيقة ، تم قلب الألواح واحتضانها عند 37 & # x000b0C لمدة 24 ساعة. (ب) في حالة عدم إصابة جزيئات الملتهمة ، ينتج عن النمو البكتيري تعليق غائم للخلايا في الأجار الناعم حيث لا تكون المستعمرات المنفصلة مرئية. بدلا من ذلك ، حتى العشب من الخلايا البكتيرية ، في هذه الحالة بكتريا قولونية، يتشكل في جميع أنحاء طبقة الأجار الناعمة بأكملها.

    الشكل 8. تحضير الصفيحة الأولية (الرئيسية) بالعينات البكتيرية. للحفاظ على العينات منظمة ، يمكن تمييز الجزء السفلي من اللوحة في شبكة ومربعات ناتجة مرقمة. يمكن تخصيص مربع لكل عينة على الشبكة. تظهر أمثلة على أنماط التلقيح الصحيحة مقابل أنماط التلقيح غير الصحيحة.من الناحية المثالية ، يتم نقل عدد صغير من الخلايا إلى وسط المربع باستخدام أداة تلقيح معقمة مثل عود الأسنان "لربس" العينة (الخلية رقم 4). تؤدي أخطاء التلقيح الشائعة ، مثل تلك الموضحة في الخلية رقم 5 ("التصحيح") والخلية رقم 6 ("ملء") ، إلى فرط نمو العينات البكتيرية بعد الحضانة ، وبالتالي تلويث المربعات المجاورة.

    الشكل 9. تستخدم تقنية لوحة النسخ المتماثلة لنقل الخلايا من اللوحات الأولية إلى الصفائح الثانوية لشاشات النمط الظاهري. تتم محاذاة العلامة الموجودة على اللوحة الأساسية مع العلامة الموجودة على الكتلة المغطاة بالقطيفة ثم يتم خفضها للسماح لسطح الأجار بالاتصال بقطعة القماش. يتم نقل الخلايا من اللوحة إلى القطيفة عن طريق الضغط برفق ولكن بالتساوي على اللوحة الأساسية بأطراف الأصابع. سيترك هذا الإجراء بصمة لعينات الخلية على القطيفة في نفس النمط المكاني مثل اللوحة الأولية. يتم استخدام نفس الإجراء لنقل الخلايا من القطيفة إلى لوحة ثانوية. يمكن تلقيح ما يصل إلى 7-8 لوحات ثانوية باستخدام نفس طبعة الصفيحة الأولية على القطيفة. يجب أن تكون اللوحة الأخيرة التي تم تلقيحها من القطيفة بمثابة عنصر تحكم إيجابي. يجب أن يكون وسيطًا يدعم نمو جميع السلالات المختبرة ، مما يضمن حدوث نقل كافٍ للخلايا خلال سلسلة اللوحات بأكملها. بعد الحضانة ، يمكن فحص الصفائح الثانوية وتسجيلها للنمو مقابل عدم النمو. وبالتالي ، يمكن فحص سلالات بكتيرية متعددة في وقت واحد على العديد من وسائط النمو في تجربة واحدة.

    الشكل 10. مثال على نتيجة باستخدام تقنية لوحة الصب. تم صرف عينة 1.0 مل من الماء التي تم جمعها من نافورة عامة للشرب في طبق بتري فارغ معقم. ثم صُب YTA المذاب ولكن المبرد في الطبق مع العينة. يحتوي الأجار أيضًا على 100 & # x003bcg / ml سيكلوهكسيميد لمنع نمو الخمائر والقوالب التي قد تكون موجودة في عينة الماء. بعد الدوران برفق للخلط ، تم وضع اللوحة على سطح مستو وسمح للأجار بالتصلب تمامًا. تم تحضين اللوحة عند 37 & # x000b0C لمدة 48 ساعة. المبينة هي نتيجة هذه التجربة. لاحظ الاختلاف في مظهر المستعمرات السطحية ، الكبيرة والدائرية الشكل ، مقابل المستعمرات تحت السطح ، والتي تكون صغيرة جدًا وغير منتظمة الشكل لأن الوسط المتصلب يمنع انتشار المستعمرات في السطح السفلي.

    الشكل 11. مثال على نتيجة باستخدام تقنية لوحة الانتشار. تم استخدام "طريقة كوباكابانا" لصفيحة خليط من خلايا الإشريكية القولونية لتجربة الفرز. في هذه الحالة ، يحتوي وسط النمو (LB) على X-Gal ، لذا فإن تلك الخلايا التي تعبر عن إنزيم وظيفي & # x003b2-galactosidase تشكل مستعمرات زرقاء بينما تلك الخلايا ذات الطفرة في لاكز الجين وبالتالي غير قادر على التعبير عن إنزيم وظيفي & # x003b2-galactosidase يشكل مستعمرات بيضاء. غالبًا ما يشار إليها باسم "الشاشة الزرقاء / البيضاء" ، يمكن تمييز نوعي المستعمرات بسهولة عن بعضهما البعض على نفس اللوحة.

    الشكل 12. نتيجة مثال لمقايسة البلاك باستخدام تقنية تراكب الأجار الناعم. تظهر لويحات تشكلت على سلالة المضيف المتفطرة اللطخة mc 2155 (ATCC 700084) بواسطة عاثيتين مختلفتين: (أ) مدمرات الفطريات و (ب) Mycobacteriophage MSSS. تم عزل هذه العاثيات من قبل الطلاب في مقرر UCLA المخبري MIMG 103L في ربيع عام 2010. M. smegmatis عبارة عن بكتيريا Actinobacterium غير مسببة للأمراض وينتمي إلى عائلة من الفطريات التي تضم عددًا قليلاً من مسببات الأمراض المعروفة بأنها تسبب أمراضًا خطيرة مثل السل (M. tuberculosis، M. africanum، M. bovis) والجذام (M. الجذام). تم تحضين ما يقرب من 50 & # x003bcl من تخفيف 10-2 من المدمرات وتخفيف 10 -3 من MSSS لكل منهما باستخدام 500 & # x003bcl من M. smegmatis لمدة 20 دقيقة عند 37 & # x000b0C ثم يخلط مع MBTA (أجار ناعم) ويصب على ألواح MHA (أجار صلب). بعد السماح للأجار الناعم بالتصلب دون إزعاج لمدة 20 دقيقة ، تم قلب الألواح واحتضانها عند 37 & # x000b0C لمدة 48 ساعة. لاحظ أشكال البلاك المميزة التي تنتجها كل فجوة. تشكل المدمرات (أ) صغيرة (متوسط ​​قطرها حوالي 1 مم) ، لويحات واضحة مميزة للعاثية اللايتية بينما تطور MSSS (B) لويحات كبيرة "عين الثور" مع مراكز واضحة محاطة بهالة عكر (متوسط ​​قطرها حوالي 3.2 مم) . قد تتكون الحلقة الضبابية من بكتيريا مقاومة لعدوى الملتهمة. يختلف هذا النمط عن ذلك الذي تشكله الملتهمة اللايسوجينية ، والتي تنتج لويحات عكرة.

    الشكل 13. نتيجة مثال باستخدام إجراء لوحة طبق الأصل. أربعة الزائفة سلالات (P. الزنجارية ، P. putida ، P. fluorescens ، و P. stutzeri) في نسختين للنمو على ثلاثة مصادر مختلفة للكربون: الأسيتاميد واللاكتوز والجليسين. (أ) الصفيحة الأولية عبارة عن وسط كامل (YTA) مُلقح بالسلالات الأربعة كما هو محدد. بعد الحضانة عند 30 & # x000b0C لمدة 24 ساعة ، تنمو جميع السلالات الأربعة على YTA. تم استخدام اللوحة الأولية لنسخة طبق الأصل من الصفيحة على وسط ضئيل (MSA) مكمل بمصدر كربون واحد: الأسيتاميد (B) واللاكتوز (C) والجليسين (D). كانت اللوحة الأخيرة في السلسلة عبارة عن لوحة YTA ذات تحكم إيجابي (E). كما هو موضح ، تظهر السلالات أنماط نمو متغيرة بعد الحضانة على الصفائح الثانوية. لاحظ أنه من الصعب أحيانًا التمييز بين النمو وبصمة الخلايا. على سبيل المثال ، قارن البصمة التي تم إنشاؤها بواسطة P. stutzeri على ثلاث لوحات MSA إلى عدم النمو على نفس اللوحات الثلاث من قبل P. الزنجارية. كلاهما نتائج سلبية مقارنة بأنماط النمو التي أظهرتها P. putida و المتألقة P.. ومع ذلك ، فإن جميع السلالات تنمو على لوحة التحكم الإيجابية التي تؤكد نقل الخلايا إلى جميع الصفائح الثانوية في السلسلة. تم جدولة نتائج هذه التجربة في الجدول 1.

    & # x000a0YTA (أساسي)MSA + أسيتاميدMSA + اللاكتوزMSA + جلايسينYTA (عنصر تحكم)
    P. الزنجارية+---+
    P. putida+++++
    المتألقة P.+++++
    P. stutzeri+---+

    الجدول 1. ملخص نتائج طلاء النسخ المتماثلة. يشار إلى النمو كعلامة زائد (+) ولا يوجد نمو يمثل علامة ناقص (-). YTA هو وسيط كامل (خميرة أجار تريبتون) و MSA هو وسيط ضئيل (الحد الأدنى من الأملاح أجار). تم استكمال لوحات MSA بمصدر كربون واحد كما هو محدد.


    النوع 2: منحنى النمو الأسي

    النوع الثاني من النمو هو الأسي.

    تزداد منحنيات النمو الأسي ببطء في البداية ، لكن المكاسب تزداد بسرعة وتصبح أسهل مع مرور الوقت. بشكل عام ، يبدو النمو الأسي شيئًا كالتالي:

    ستجد أيضًا فرصًا للنمو الهائل في الحياة اليومية (على الرغم من أنني أعتقد أنها أقل انتشارًا).

    • الاستثمارات والثروة: بفضل قوة الفائدة المركبة ، تبدأ مدخراتك التقاعدية ككنز صغير في السنوات الأولى ، ولكنها تتضخم في الحجم خلال العقد أو العقدين الأخيرين من المدخرات.
    • مشتركو البريد الإلكتروني وزيارات الموقع: تتلقى مواقع الويب الجديدة عددًا هائلاً من الزيارات هنا وهناك ، ولكن مع مرور الأسابيع والأشهر على هذه الهزات ، يمكن أن تتحول إلى نهر هائج من الزوار والمشتركين.
    • ريادة الأعمال ونمو الأعمال: تتراكم الأصول التي تنشئها لعملك فوق بعضها البعض وتتراكم الإيرادات طوال حياة الأعمال الناجحة.
    • متابعو وسائل التواصل الاجتماعي: عندما يكون لديك 100 متابع فقط ، فقد يستغرق الحصول على 100 متابع آخر ستة أشهر. ومع ذلك ، بمجرد أن يصبح لديك 1000 متابع ، قد يستغرق الحصول على المائة التالية شهرًا واحدًا فقط. بمجرد أن يصبح لديك 100000 متابع ، قد يستغرق الحصول على 100 متابع آخر يومًا واحدًا. كرات الثلج معدل النمو الخاص بك.

    الفئات غير الجينية للطب والبيئة

    في الطب ، يتم تحديد الكائنات الحية الدقيقة من خلال علم التشكل وعلم وظائف الأعضاء والسمات الأخرى في علم البيئة من خلال الموطن والطاقة ومصدر الكربون.

    أهداف التعلم

    حدد السمات المستخدمة في التصنيف: البكتيريا والفيروسات والكائنات الحية الدقيقة في علم البيئة

    الماخذ الرئيسية

    النقاط الرئيسية

    • يسبب العامل الممرض المرض في مضيفه. في الطب ، هناك عدة أنواع واسعة من مسببات الأمراض: الفيروسات والبكتيريا والفطريات والطفيليات حقيقية النواة والبريونات.
    • عند التعرف على البكتيريا في المختبر ، يتم استخدام الخصائص التالية: تلطيخ الجرام ، والشكل ، ووجود كبسولة ، وميل الترابط ، والحركة ، والتنفس ، ووسط النمو ، وما إذا كان داخل الخلايا أو خارجها.
    • تصنف الفيروسات أساسًا حسب الخصائص المظهرية ، مثل التشكل ونوع الحمض النووي وطريقة التكاثر والكائنات الحية المضيفة ونوع المرض الذي تسببه.
    • في علم البيئة ، تصنف الكائنات الحية الدقيقة حسب نوع الموطن الذي تتطلبه ، أو المستوى الغذائي ، ومصدر الطاقة ومصدر الكربون.
    • لقد وجد علماء الأحياء أن الحياة الميكروبية تتمتع بمرونة مذهلة للبقاء في البيئات القاسية التي قد تكون غير مضيافة تمامًا للكائنات المعقدة التي تسمى الكائنات القاسية وتوجد أنواع كثيرة.
    • تستخدم الأنواع المختلفة من الكائنات الحية الدقيقة مزيجًا من مصادر مختلفة للطاقة والكربون. قد تكون هذه بدائل بين التغذية الضوئية والكيميائية ، بين التغذية العضوية والليزوتية ، بين التغذية الذاتية وغير المتجانسة أو مزيج منها.

    الشروط الاساسية

    • تلزم: قادر على الوجود أو البقاء على قيد الحياة فقط في بيئة معينة أو من خلال تولي دور معين: طفيلي ملزم ولا هوائي ملزم.
    • العوامل الممرضة: أي كائن حي أو مادة قادرة على إحداث المرض ، مثل البكتيريا أو الفيروسات أو الكائنات الأولية أو الفطريات ، وخاصة الكائنات الدقيقة. لا تعتبر الكائنات الحية الدقيقة من مسببات الأمراض حتى تصل إلى حجم سكانية كبير بما يكفي لإحداث المرض.
    • مغرم: كائن يعيش في ظروف قاسية من درجة الحرارة والملوحة وما إلى ذلك. إنها مهمة تجاريًا كمصدر للإنزيمات التي تعمل في ظل ظروف مماثلة.

    تصنيف الكائنات الدقيقة في الطب

    العامل الممرض (المعروف بالعامية باسم الجرثومة) هو عامل معدي يسبب المرض في مضيفه. في الطب ، هناك عدة أنواع واسعة من مسببات الأمراض: الفيروسات والبكتيريا والفطريات والطفيليات حقيقية النواة والبريونات.

    بكتيريا

    على الرغم من أن معظم البكتيريا غير ضارة ، إلا أنها مفيدة ، إلا أن القليل منها مُمْرِض. كل نوع مُمْرِض له طيف مميز من التفاعلات مع مضيفيه من البشر.

    بشكل مشروط ، تكون البكتيريا المسببة للأمراض مسببة للأمراض فقط في ظل ظروف معينة مثل الجرح الذي يسمح بدخول الدم ، أو انخفاض في وظيفة المناعة. يمكن أيضًا تصنيف الالتهابات البكتيرية حسب الموقع في الجسم ، على سبيل المثال ، المهبل والرئتين والجلد والحبل الشوكي والدماغ والمسالك البولية.

    عند التعرف على البكتيريا في المختبر ، يتم استخدام الخصائص التالية: تلطيخ الجرام ، والشكل ، ووجود كبسولة ، وميل الترابط (منفردة أو في أزواج) ، والحركة ، والتنفس ، ووسط النمو ، وما إذا كان داخل الخلايا أو خارجها.

    تم تصميم تقنيات الاستزراع للنمو والتعرف على بكتيريا معينة ، مع تقييد نمو البكتيريا الأخرى في العينة. غالبًا ما يتم تصميم هذه التقنيات لعينات محددة: على سبيل المثال ، سيتم معالجة عينة من البلغم لتحديد الكائنات الحية التي تسبب الالتهاب الرئوي. بمجرد عزل الكائن المُمْرِض ، يمكن تمييزه بشكل أكبر بمورفولوجيته وأنماط نموه (الهوائية أو اللاهوائية) وأنماط انحلال الدم والتلطيخ.

    الفيروسات

    على غرار أنظمة التصنيف المستخدمة للكائنات الخلوية ، فإن تصنيف الفيروسات هو موضوع نقاش مستمر بسبب طبيعتها الزائفة الحية. في الأساس ، هي جسيمات غير حية لها بعض الخصائص الكيميائية المشابهة لتلك الموجودة في الحياة ، وبالتالي فهي لا تتناسب بدقة مع نظام تصنيف بيولوجي راسخ.

    تصنف الفيروسات بشكل أساسي حسب الخصائص المظهرية ، مثل:

    • علم التشكل المورفولوجيا
    • نوع الحمض النووي
    • طريقة النسخ المتماثل
    • الكائنات المضيفة
    • نوع المرض الذي تسببه

    يوجد حاليًا نظامان رئيسيان يستخدمان لتصنيف الفيروسات: (1) نظام اللجنة الدولية لتصنيف الفيروسات (ICTV) و (2) نظام تصنيف بالتيمور ، الذي يضع الفيروسات في واحدة من سبع مجموعات. حتى الآن ، تم إنشاء ستة أوامر من قبل ICTV:

    • كودوفيراليس
    • الهربس
    • مونونيغافيراليس
    • نيدوفيراليس
    • بيكورنافيراليس
    • تيموفيراليس

    تشمل هذه الطلبات فيروسات ذات نطاقات مضيف مختلفة ، بعضها فقط يصيب مضيفين بشريين.

    تصنيف بالتيمور هو نظام يضع الفيروسات في واحدة من سبع مجموعات اعتمادًا على مجموعة من:

    • حمضهم النووي (DNA أو RNA)
    • تقطعت بهم السبل (مفردة أو مزدوجة)
    • يشعر
    • طريقة النسخ المتماثل

    يتم تحديد التصنيفات الأخرى حسب المرض الذي يسببه الفيروس أو شكله ، ولا يعتبر أي منهما مرضيًا لأن الفيروسات المختلفة يمكن أن تسبب نفس المرض أو تبدو متشابهة جدًا. بالإضافة إلى ذلك ، غالبًا ما يصعب تحديد الهياكل الفيروسية تحت المجهر. إن تصنيف الفيروسات وفقًا لجينومها يعني أن أولئك الموجودين في فئة معينة سيتصرفون جميعًا بطريقة مماثلة ، مما يوفر بعض المؤشرات على كيفية المضي قدمًا في مزيد من البحث.

    تتسبب الكائنات الحية الأخرى دائمًا في حدوث المرض لدى البشر ، مثل إلزام الطفيليات داخل الخلايا القادرة على النمو والتكاثر فقط داخل خلايا الكائنات الحية الأخرى.

    فئات الكائنات الدقيقة في علم البيئة

    في علم البيئة ، تصنف الكائنات الحية الدقيقة حسب نوع الموطن الذي تتطلبه ، أو المستوى الغذائي ، ومصدر الطاقة ومصدر الكربون.

    نوع الموطن

    اكتشف علماء الأحياء أن الحياة الميكروبية تتمتع بمرونة مذهلة للبقاء في البيئات القاسية التي قد تكون غير مضيافة تمامًا للكائنات الحية المعقدة. حتى أن البعض استنتج أن الحياة ربما تكون قد بدأت على الأرض في فتحات حرارية بعيدة تحت سطح المحيط.

    ان مغرم هو كائن حي يزدهر في ظروف جسدية أو جيوكيميائية قاسية ، مما يضر بمعظم الحياة على الأرض. معظم الكائنات الحية المتطرفة المعروفة هي الميكروبات. المجال العتيقة يحتوي على أمثلة مشهورة ، ولكن الكائنات المتطرفة موجودة في العديد من السلالات الجينية المتنوعة لكل من البكتيريا والعتيقة. في المقابل ، يمكن تسمية الكائنات الحية التي تعيش في بيئات أكثر اعتدالًا ميسوفيليس أو العدلات.

    هناك العديد من الفئات المختلفة من الأشخاص المتطرفين ، كل منها يتوافق مع الطريقة التي يختلف بها مكانتها البيئية عن ظروف الحياة المتوسطة. العديد من المتطرفين تندرج تحت فئات متعددة ويطلق عليهم بوليكستريموفيليس. بعض الأمثلة على أنواع المتطرفين:

    • أسيدوفيل: كائن حي يتمتع بنمو مثالي عند مستويات pH 3 أو أقل
    • زيروفيل: كائن حي يمكن أن ينمو في ظروف شديدة الجفاف والجفاف تتمثل في ميكروبات التربة في صحراء أتاكاما.
    • الهالوفيل: كائن حي يتطلب على الأقل تركيزات 0.2M من الملح (كلوريد الصوديوم) للنمو
    • ثرموفيل: كائن يمكن أن يعيش في درجات حرارة تتراوح بين 45-122 درجة مئوية

    المستوى الغذائي ومصدر الطاقة ومصدر الكربون

    الأنماط الغذائية للكائن الحي: مخطط انسيابي لتحديد ما إذا كان النوع ذاتي التغذية أو غير متجانسة أو نوع فرعي.

    • فوتوتروفس: إجراء التقاط الفوتون للحصول على الطاقة. يستخدمون الطاقة من الضوء لتنفيذ عمليات التمثيل الغذائي الخلوي المختلفة. فهي ليست ضوئية إجبارية. معظم الصور الفوتوغرافية المعروفة هي التغذية الذاتية، المعروف أيضًا باسم فوتوتروفسويمكنه إصلاح الكربون.
    • التغذية الضوئية: إنتاج ATP من خلال الفسفرة الضوئية ولكن استخدام المركبات العضوية التي تم الحصول عليها بيئيًا لبناء الهياكل والجزيئات الحيوية الأخرى.
    • Photolithoautotroph: كائن ذاتي التغذية يستخدم الطاقة الضوئية ، ومتبرع إلكتروني غير عضوي (على سبيل المثال ، H2أوه2، ح2S) و CO2 كمصدر للكربون.
    • التغذية الكيميائية: الحصول على طاقتهم من خلال أكسدة المتبرعين بالإلكترون في بيئاتهم.
    • كيميائي عضوي: الكائنات الحية التي تؤكسد الروابط الكيميائية في المركبات العضوية كمصدر للطاقة وتحصل على جزيئات الكربون التي تحتاجها للوظيفة الخلوية. تشمل هذه المركبات العضوية المؤكسدة السكريات والدهون والبروتينات.
    • المواد الكيماوية التغذوية (أو التغذية العضوية) تستغل المركبات منخفضة الكربون كمصادر للطاقة ، مثل الكربوهيدرات والدهون والبروتينات من النباتات والحيوانات. المواد الكيميائية المغايرة (أو حصريةغيرية التغذية) استخدام المواد غير العضوية لإنتاج ATP ، بما في ذلك كبريتيد الهيدروجين والكبريت الأولي.
    • ليثوتوتروف: تستمد الطاقة من المركبات المختزلة ذات الأصل المعدني. قد يشار إليها أيضًا باسم كيميائيات، مما يعكس مسارات التمثيل الغذائي ذاتية التغذية. lithoautotrophs هي ميكروبات حصرية ومعظمها من البكتيريا. بالنسبة للبكتيريا lithoautotrophic ، يمكن استخدام الجزيئات غير العضوية فقط كمصادر للطاقة.
    • ميكسوتروف: يمكن استخدام مزيج من مصادر مختلفة للطاقة والكربون. قد تكون هذه تباينات بين التغذية الضوئية والكيميائية ، بين التغذية العضوية والضوئية ، بين التغذية الذاتية وغير المتجانسة أو مزيج منها. يمكن أن تكون حقيقية النواة أو بدائية النواة.

    اختلاف الشكل في فيروسات الهربس المختلفة: فيروسات مختلفة من عائلة Herpesviridae شوهدت باستخدام صورة مجهرية إلكترونية. من بين هؤلاء الأعضاء الحماق النطاقي (جدري الماء) ، والهربس البسيط من النوع 1 و 2 (HSV-1 ، HSV-2).


    شاهد الفيديو: Microbiology - Bacteria Growth, Reproduction, Classification (شهر نوفمبر 2022).